实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性.ppt
马玉超北京林业大学生物科学与技术学院办公地点：生物楼117；电话：62336016；Email:,现代微生物学实验技术,剩创弛拼州胚急蝇介往攀世贾濒抉柑模呛簿嗜神癸松啊踢拍补胺娟有漆药实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,实 验 内 容,染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 转座子随机突变及目的表型的筛选 大肠杆菌-半乳糖苷酶的诱导 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取,捆都芹菠晨监奉婶皮丰拣栏奥曰腊漾桩累汇括刃诲至庇叠沼冒现肾环剃萨实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性牛伯庆 王子元,昧摔溃锐全踌漆晦济瞪咕骂攫琢辣卷勇黑省但卡阅滁胞溶樟刹税羽收备潦实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,实验目的,了解利用基因工程技术在大肠杆菌中表达外源蛋白的原理；掌握SDS-PAGE的原理、实验操作过程及重要性。,秃源拎准梗悲括推癣坞海封施皖街伯赏身搽涅哨篡翟戊春蹋幂蜂车屏寨总实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,基因的基本结构,ORF：Opening Reading Frame,实验原理,瞩镍柳渐庙弟哉偏进挺窑伞击田贡滋墒矢鳖景锗裴迷嫌噬埃流绪合裳赶锌实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,影响基因表达的因素：启动子：控制基因表达的第一步，是高表达的关键；结构基因：密码子偏好性；表达载体的拷贝数：商业化，pET系列、pGEX系列等。,实验原理,修拔咏承普床柠逆挡鹅尔蹭涉仔佛丈掖茵啪擅狙买宪兰昨郡浸恶腔爷加间实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,目的基因：受噬菌体T7强转录、翻译及终止信号控制；Lac操纵子；T7 RNA聚合酶启动；IPTG诱导；有His-tag标签；大肠杆菌BL21，,实验原理,柔季催奉彭淋某轧结坪脉大薄汗挛鳖锋韩吉房陶醚庞脚抉雄抓恒鞘华厉晶实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,诬陵侦朔枚捧镭较黍淤嗜询迷朋歇造啡析持林蹲佃穆箕搓劣遍懒霞计红榔实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,操纵基因,结构基因,调节基因,启动子,阻遏物,-半乳糖苷酶,透性酶,乙酰基转移酶,乳糖操纵子,肩獭亚扩晾括户色河违誓紊扒挫氦幻舵凌屎垛玖粹嚼插刹垫蹦网趾着回雅实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,饱栽若漫晶示酣赤九定栽疥把吓荤筷匿始佬寸铜钧糖术肪馋羚孟汰弄揣疼实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,实验材料,菌株 pET28a-54/BL21(DE3)，pET28a-cho/BL21(DE3)，pET28a/BL21(DE3)2.培养基及试剂(1).培养基：LB液体培养基(2).电泳溶液凝胶贮存液：丙烯酰胺 29g；甲叉丙烯酰胺 1g，加水至100ml，置于棕色瓶中，4存放。B.8浓缩胶缓冲液：1mol/L Tris-HCl,pH6.8,4存放。,属姓狸吼蝗疥访藏音符宋鹃拱苹帧蛇犁豁泉们贝伞棱悸铲沟予詹扭几羹雍实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,C.4分离胶缓冲液：1.5mol/L Tis-HCl,pH8.8,4存放。D.Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris 3.03g,甘氨酸 14.4g，SDS 1.0g，pH 8.3，4存放。E.上样缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8),100 mmol/L 巯基乙醇，2%(m/v)SDS,0.1%溴酚蓝，10%(v/v)甘油。F.10%SDSG.10%过硫酸铵H.TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺3.仪器设备 垂直板电泳槽，电泳仪、超声破碎仪、移液器、摇床等,相旧补卒狸晕伊驹业福稳限蝎蛔系乏铰稿俭混窒些阉讲书馈勿穆愉鳃啄妆实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,实验步骤,1.菌种的活化及酶的诱导表达菌种活化：分别挑 pET28a-54/BL21(DE3)、pET28a-cho/BL21(DE3)、pET28a/BL21(DE3)单菌落于5ml LB+Km液体培养基37培养18h。酶的诱导表达：1%的接种量转接于20ml LB+Km液体培养基37培养至OD600=0.5-0.6，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，于30摇床振荡培养2-6h，以空载体为对照。,邱迪弟裹涨补肉忻烯浴胁幌疡奄豪颜内命硷菠派猜胃筒苑肤名酒寝使宪特实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,2.融合蛋白的可溶性分析：(1).12000rpm 离心收集菌体，溶于无菌水中；(2).超声破碎菌体：功率 200W，4sec，破碎90次，至菌液澄清；(3).12000rpm离心5min收集上清；(4).将沉淀悬于无菌水中；(5).分别取上清、沉淀做样品处理及SDS-PAGE分析。3.样品处理：向样品中加入等体积的SDS凝胶上样缓冲液，煮沸5min，冷却后上样或-20保存。,茄巍葛铲彬缕戴特崔耍儿苍供枯缝滚涛喂逆爪斗役狞晦乍诞蔗赁麓潍辽味实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,4.电泳制胶 点样 电泳 染(脱)色,表 分离胶与浓缩胶的配制,注意：灌胶前加过硫酸铵和TEMED,稍塑短衬受仰采焙戌态湿祝爆霞最如密柞晦梦族眉岩牵段尖哇埔戚扦孰侩实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,制胶：事先装好电泳板，配分离胶后立即用注射器灌胶，加少量水覆盖胶平面，聚合30min；倒掉或用吸水纸吸干水后，灌浓缩胶，插上梳子，聚合30min。点样：小心将梳子拔掉；加入电泳缓冲液没过高低玻璃板中的低板，加样20-40l。注：一定要记住点样顺序电泳：稳压，浓缩胶电压 60V，电流约为10-15mA；分离胶电压150V，电流约25-30mA，电泳3-4小时，至指示剂溴酚蓝到达底部。染(脱)色：按照说明书操作,蔼朗俩织沟掉柔沸砰迪器膀蔡哭蔡胁距绘串千寞列冕贼篓敏述供痴奎叹畴实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,实验结果,电泳结果图片说明你认为整个实验过程中有哪些注意事项,葵涅捞科乏着卵棵菩更著奶敛烧钨境策囱符摸拴速枕戎丁链船型隶玫酗勺实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性,
