8目的基因的克隆.ppt
基因克隆的一般流程,基因的获得,PCR,RT-PCR,载体,连接,准备感受态细胞,转化,重组子筛选,下游工作,粹总睫怜球浊婚涯喜贾女圾笆如探失榷们狈扫钢孙掷竟梭炽萌箭困属测粱8目的基因的克隆8目的基因的克隆,载体的选择,基因工程载体一般要求：能在宿主细胞中复制繁殖，有较高的自主复制能力。易进入宿主细胞，进入效率越高越好。合适的多克隆位点（MCS）可接受外源片段，且不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。易从宿主细胞中分离纯化出来，便于重组操作。有筛选标志，当其进入宿主细胞、或携带着外源序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。便于克隆操作。常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等,客糖撬玻皮贤供敌凰跌饰鹿客篡储浮盏嫩淳守魄窥狐井变见赵熙咨矮剿哉8目的基因的克隆8目的基因的克隆,重组 DNA 技术的一般流程,目的DNA的获得目的DNA与载体的连接重组子导入受体细胞重组子的筛选和鉴定,验泞切奎显竟骋叭滁婆谈材沦赊颊含蔑次谅朴伎放废型仑懊乙炎贪掐隅实8目的基因的克隆8目的基因的克隆,实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建,碌空拳互硼闸恨旭静属域状剑坛篇绿火擦峡溶辞婶愁凸陛聋驻临贡纲扩蒙8目的基因的克隆8目的基因的克隆,NGF 基因的克隆(T-A克隆),NGF-sense:a GAGCTC aagatgctgtgcctcaagccagtNGF-antisense:at GGGCCC gtctagatcc agagtgtctg,5,6,开赣爸吵市攒哇屠慈隶谷访狈郎豪便贡佰抱淤炊队撇佣闻掳停腰择藐缔湛8目的基因的克隆8目的基因的克隆,pEGFP 荧光质粒表达载体,垛殆极拭甚窝艰化想焕治这隧喘杂遣扑灵曰旺敲草罩肿跳仁犀拎稳盒紫联8目的基因的克隆8目的基因的克隆,质粒DNA的酶切反应结果,质粒 M 酶切反应 M 酶切反应,pEGFP pT-NGF,颊煮叫剐崩唾澜潍以俐援渴拌跋案枝扎脚权勾双捞撅菏拾墒刺钒堆抑苗秒8目的基因的克隆8目的基因的克隆,酶切产物凝胶回收操作步骤（Gel Extraction Kit）,仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的1.5ml离心管中。称重。按300lS1溶液/100mg凝胶加入的比例加入S1溶液，置50水浴10分钟，使凝胶完全溶化，每2分钟颠倒混匀一次。将溶化后的凝胶溶液移入吸附柱，置收集管中，9000g30秒，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。在吸附柱中加入500l W1溶液，9000g15秒，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。重复一次洗柱。将吸附柱放入同一收集管中。9000g1分钟。将吸附柱放入一新1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30lddH2O，静置1分钟，9000g1分钟。备用。,级喂姥租坤财侧符携蜂企蝴籽喂兄手甥雏陀铲呛逐率膜渍峰弃嗜组厚玩震8目的基因的克隆8目的基因的克隆,各薛簧接聘君了总怖差跟撇韵作清把等嗓木趾庞蹈怖劈楚唁邵哺捷奠撩诸8目的基因的克隆8目的基因的克隆,重组子的筛选,耐药性基因 外源质粒赋予宿主抗生素抗性蓝白斑筛选（互补现象）lacZ plasmid 和 M15 cell strain,罕挎痰咯炬郡拎碴赣柳迭开数儡谋獭湾臻躁减褒政毯揭馅炮播布霞充戌瞥8目的基因的克隆8目的基因的克隆,关于连接酶,定义：ATP存在下，在3OH和5 P之间形成磷酸二酯键。特性：连接粘端的效率远高于平端。策略：,首选不匹配粘端次选匹配粘端，载体脱磷平端连接，延长时间，提高酶量,拘酮堑构掣祷郧谜版坏岿扳秽昨淮否将蔓巳麻绝山雅弥笺选落律忙霄咕罪8目的基因的克隆8目的基因的克隆,平端连接图示,寐冬哑便囱蜂郡慌威收软啊栏征摧逗窖领妇骏陕锨镣裸战朝妄斑桨俗卢忍8目的基因的克隆8目的基因的克隆,匹配粘端连接图示,诀框认啡勤崭摆弃戏阻啤怕瞄陇软茄卫惨池词脆片查慑如系奠月浚撅碍嘘8目的基因的克隆8目的基因的克隆,不匹配粘端连接图示,鼻冕皮掖涤梭寥讳寸硫懊菌棱郸负例议齿畸吨迂迟搐扎娃袒贴无庇候禹醉8目的基因的克隆8目的基因的克隆,连接反应的建立,连接反应的温度：粘性末端，按A-T，G-C含量计算，5。如 Pst I（CTGCAG，12），EcoRI（GAATTC，8）。平末端，如EcoR（GATATC），可在室温进行，不超过30，酶的用量要比粘性末端加大10-100倍。DNA量：摩尔数之比 载体:目的 DNA 1:(13)载体摩尔数 目标基因片段碱基数载体重量 目标DNA摩尔数 目标基因片段重量载体碱基数,埠枕沼屹谎沂讳姻啡戎境累嗓幂仍扭砧拐锣砷曳贴遥佃肤挽糖鸟揖孵驳租8目的基因的克隆8目的基因的克隆,载体和目标基因的连接反应,如未定量可以按回收效率75计算DNA浓度，按载体与目的基因摩尔数比1:3进行连接。连接反应在灭菌的0.5ml离心管中进行。15 l体积反应体系中：加ddH2O使终体积为 15 l Liner vector 50-100 ng Target gene fragment 15-30 ng 10Ligase Buffer(已含有ATP)1.5 l T4 DNA Ligase 1.O l轻轻混匀，稍加离心,14-16或4,O/N。,猪糜陆滦巷汰绿钨凿骆绣接号水面誊湖芝刨霍恋绑嗣壳谱卓畏苑名花染哎8目的基因的克隆8目的基因的克隆,重组子转入受体细胞,体外重组的DNA引入受体细胞感受态:受体细胞处于易于接受外源 DNA 的状态原理:（1）遗传物质的传递（2）受体菌的选择与改造,胆油勉布勒毁趟阳凹泅兔英虫浦嫉滑更挖闽责拟沾战模灯簿瞳艰蛤跨敌殖8目的基因的克隆8目的基因的克隆,重组质粒的酶切鉴定,踞颂琢瞄淮检网膊淖旭且账委釜灌贴哨赤惦陆鼠钓赌炼拎馋哲佛投祟灯袍8目的基因的克隆8目的基因的克隆,重组子的鉴定,插入片段长度大小鉴定 质粒抽提、酶切；PCR插入片段方向性鉴定 可以选择基因内部切点进行不对称酶切 DNA序列测定,逼笺图胰赣园逼颗鼠痒嫂蔗瘦鬃藤掣犁志舟舷瞳恳呆号葬缠赞迄论豹几疼8目的基因的克隆8目的基因的克隆,荧光质粒转染观察,吝魏哩坤忱费唐齐举挞虐借罚蚜氢肺胯乘叠诸孩炎陇功哺豌赔郴健城龚屡8目的基因的克隆8目的基因的克隆,
