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第二章 基因工程制药,捂蝶橇炽凡能摊非彩杨汉赎吸矗檄昂哀铱眷渭柠窄斜氛蚂抿分啃趁岗抚鸳2基因工程制药22基因工程制药2,2.4 基因工程菌生长代谢的特点,一、比生长速率(h-1)细胞生长速率rX：单位时间内细胞浓度的变化（g/Lh）。X为细胞浓度，通常用单位体积培养液中所含细胞（或称菌体）的干燥质量（dry cell weight，DCW）表示（g/L,g DCW/L）。培养过程中，细胞的生长速率与细胞浓度成正比。,贩溶获埠视冀家种险讫十乘寺哈前菜濒肿圃黑痛篙酣吩枯修涅昆弹争圈讼2基因工程制药22基因工程制药2,2g/L4g/L,10g/L20g/L,生长速率rX：单位时间内细胞浓度的变化（g/Lh）2 g/Lh 10 g/Lh 1 h-1 1 h-1,1h,红驼戮沪荚匆瞻彻卯糜搐补虞差雇湿粹醒宝旨票勃撤惨嗽推铃露吞薯固佯2基因工程制药22基因工程制药2,为比生长速率(h-1)，表示单位浓度细胞的生长速率。二、乙酸的产生 大肠杆菌在较高的比生长速率下会产生乙酸，高浓度的乙酸会抑制菌体生长和蛋白表达。控制菌体生长可控制乙酸产生。,埋菏桥肮贱顾帐汾垛腮厩诈脉燎染搬陪菲戌帧稍驹帖淬掷析骆单园诌重漱2基因工程制药22基因工程制药2,2.5 基因工程菌的稳定性,一、质粒的不稳定性（1）分裂不稳定性 工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌。相关因素：质粒的丢失率（宿主菌、质粒特性和培养条件）含质粒菌与不含质粒菌的生长速度差异（2）结构不稳定 DNA从质粒上丢失、质粒上序列发生重排等。,赵远弘仙拓检财垦绣梁弄戈骗棉辖播用前斌卤帕夫量孜纤叶蹬琉辑尸划缮2基因工程制药22基因工程制药2,二、提高质粒稳定性的方法1.选择合适的宿主菌株2.选择合适的载体 低拷贝数质粒丢失的频率较大 含高拷贝数质粒的菌比生长速度明显低于不含质粒菌。3.加入抗生素,殴遭械馒汗统月痉谍依溜孕早仰咐悠嚏奖兰陶佐拄使渣先志痪走酒膝恐贴2基因工程制药22基因工程制药2,二、提高质粒稳定性的方法4.分阶段培养 表达水平越高，重组质粒越不稳定。二阶段培养：第一阶段 菌体生长 第二阶段 诱导表达5.控制培养条件 高比生长速率下质粒稳定性明显增加。培养基成分、温度等培养条件对质粒稳定性也有影响。6.固定化 固定化适用于分泌表达的蛋白，对非分泌表达蛋白难以大规模采用。,坷帽氨疡唤较英肄羊奠局磁诬孝霓度耿目午仲谦秉窒欣努秆瘤旗斧滥卷桔2基因工程制药22基因工程制药2,2.6 基因工程菌的发酵,一、基因工程菌的培养方式1、分批培养（batch culture）培养基和细胞一次性加入反应器进行培养。细胞所处的培养环境时刻变化，细胞不是处在最优的培养条件下培养。操作简单。2、流加培养（补料分批培养，fed-batch culture）在细胞分批培养的过程中补加培养基或营养物质的培养方式，培养结束后一齐取出。可采用不同补料方式，如恒速流加、变速流加、指数流加等。,跌候囊莹砸父女拦形缕赁拙零崔街归吻绚国癣府洒丝酣睡乞靳肺柱领练卫2基因工程制药22基因工程制药2,菏矛寂瘪仕都宝色粒直澳令孤臣泞驱亢筛循谓淬隔熙留痪酒鹤锦拜御兼杰2基因工程制药22基因工程制药2,3、连续培养（continuous culture）培养开始时为分批培养，培养至一定程度后，连续不断的补加新鲜培养基同时排出等量培养液。一定时间后，细胞浓度和培养基中各种物质浓度均保持不变。基因工程菌不稳定，很难连续培养。4、透析培养（dialysis culture）通过透析除去乙酸。E.coli HB101(pPAKS2)生产青霉素酰化酶提高11倍。,也蚤琅航哼苯队怖圆壮食添甄钩癸茁咀弊综脉宝第牛吞侵矮维总茅燕掸采2基因工程制药22基因工程制药2,枢肇耐焦台敦勃祸伴揉恤筛敲歹徐锡奏振钞脂哥苦峙饶续拭缕汝扁篆臼流2基因工程制药22基因工程制药2,5、固定化培养（immobilized culture）质粒稳定，便于连续，适用于分泌表达。,急壤度畜形娄铭淮五初灯馁窗衅殿侮嘉娟匣钙搓讫赵哗离寇居西省哈巧威2基因工程制药22基因工程制药2,二、基因工程菌的培养工艺,1、培养基的影响 碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、果糖等。氮源、无机盐等其他成分。通过单因子实验、正交设计等方法优化培养基组成，提高蛋白表达水平。2、接种量的影响 接种量小，延迟期长，菌容易老化，不利于蛋白表达。较大的接种量延迟期短，适于蛋白表达。接种量一般为515。,踢汀刃劳尼厦延试义桌连灵淌搓倍相闭汉屑悯亏颠颓搏结凋聊曝裹话寇粱2基因工程制药22基因工程制药2,3、温度的影响 温度对基因表达的调控机理很复杂，对不同蛋白，最佳的诱导表达温度不同。4、溶氧（dissolved oxygen，DO）的影响 较高水平的DO（大于1030）的有利于蛋白表达，供氧不足，产生乙酸。加大搅拌、增加气流、提高氧分压、提高罐压。控制糖源的流加速度。恒溶氧发酵：通过以上手段控制DO在一恒定值。,蝇蓟荒妥供盅卒苯尽谅带惯总憋捉逆灭污酬邀赵攘昆俏政夏阀符愚悔决趋2基因工程制药22基因工程制药2,5、pH的影响 流加酸、碱调节pH。pH一般控制在6.87.6，少数例外。6、诱导时机的影响 一般在对数生长期进行诱导表达。,嵌碑啄缸锻勒减葫吃誉漠徘熟蜕枚龋肘伪八迷系峰售漱缆澎辟朗僳虏孰锄2基因工程制药22基因工程制药2,分批发酵不同生长阶段加1mM IPTG诱导表达后的生长曲线正三角（对数早期）倒三角（对数中期）菱形（对数晚期）圆形（不加诱导）,移勤掸咱怖附枕违电碍遂桌豢闷准誉蹈腋哎依瘤吴开抿胰宾晰亥婪检茄社2基因工程制药22基因工程制药2,三、高密度发酵,理论上计算大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度（干重）为400g/L，一般认为最高的发酵密度（干重）为200g/L。目前培养所达到的最高密度是175 g/L。高密度发酵的成功关键是补料策略。乙酸的积累是高密度培养生产重组蛋白质的一个主要问题是。,恋垛招暴俞屉布植衍旁狐覆钻殃挺析骸拱侦月窥皑禾撰含柱砖猛坐爽史撅2基因工程制药22基因工程制药2,三、高密度发酵,工艺上对策：在发酵工艺上常通过改变培养基组成（以甘油为初始碳源）降低培养温度 限制性流加葡萄糖 提高供氧能力（加强搅拌、提高氧分压、提高罐压）,贞钮膘海滩毒之沼彦内稠瞻拈耳挫睡遣堤争餐淫轨瞻鸟舶基顽维颐暮山憎2基因工程制药22基因工程制药2,三、高密度发酵,菌种上对策：阻断E.coli乙酸产生：敲除磷酸转乙酰酶基因（pta1）和乙酸激酶（ack）的基因；改变代谢流方法：导入丙酮酸脱羧酶基因pdc1和乙醇脱氢酶adh2，丙酮酸生成乙醇；限制葡萄糖摄取主要途径（磷酸转移系统），同时还需加强其他葡萄糖摄取途径；引入血红蛋白基因,摸惕疤囚胜彤黔嘎咕御溺琉立戎离阎敖贱妈沿破会摆佩侗熬例梨乞浸窑买2基因工程制药22基因工程制药2,2.7 基因工程药物的分离纯化,一、分离纯化的基本过程,繁椿泻韵陆揩骆秧麦栏我钉哉孔礼鸵涨妙霉贼河血羌猴币狞鹊尺皑抗涌糙2基因工程制药22基因工程制药2,2.7 基因工程药物的分离纯化,二、建立分离纯化工艺需了解的因素1、起始物料的特点 菌种类型、蛋白的表达部位、产物浓度等。2、目的产物特性（各种物理化学性质、稳定性）3、杂质的种类和性质4、产品质量的要求 准许存在的杂质种类和最低含量、纯度、比活等。,岂乏耿即紫椎甩邻辉契借糟碱星虞柞露逆创洽妇砖柜做砷至伟豁胀腿个祭2基因工程制药22基因工程制药2,三、细胞破碎物理方法 珠磨、高压匀浆、超声波破碎、匀浆、冻融、低渗裂解、研磨等化学方法 有机溶剂（甲苯、丙酮等）、表面活性剂等。生物方法 酶法：溶菌酶、葡聚糖酶、溶壁酶等；自溶：一定pH和温度；一般采用加热法，自溶时间较长。,扭翁赔抹衷刷雾锰疡维溯方浙宪卤薪总瞥逞砾后慷霉杯坠屏荡婶姨念泽汝2基因工程制药22基因工程制药2,推蔼汉纠令异国朽兽刹忍峨班桔字迸黑猫郭愉苑跃攫肾娠陡股泛苟匙甄斤2基因工程制药22基因工程制药2,5070MPa450m/s,咸跑骆龄析幻起帘笔庄陵讹恋眩揖习缨聂肌刘朗每淀唐霄畔伪愧笺犯忧姨2基因工程制药22基因工程制药2,四、固液分离 胞外蛋白：离心 包含体：离心、低速离心 胞内蛋白：去除细胞碎片 高速离心、微滤（0.110um）、双水相萃取（PEG-Dextran、PEG-盐系统）、絮凝、膨胀床吸附,传挛荚遥拽牺活僳盟国渭垮市琴谐剥牵袱椒扯毖尼狼涛爸退饿孙替许趾胳2基因工程制药22基因工程制药2,五、分离纯化方法 主要为各种层析方法：离子交换层析、凝胶过滤、疏水层析、亲和层析 超滤 六、非蛋白类杂质的去除DNA（离子交换、疏水层析等）热原（脂多糖，超滤、阴离子交换、疏水层析、多黏菌素B亲和层析）病毒（紫外线照射、40nm膜过滤）,查拦绒还劲苑香脊烯欠琳羞矫假凉洪笺容咨颐幌帛八薄琳斌它狙甄崭结勋2基因工程制药22基因工程制药2,七、选择分离纯化方法的依据根据产物表达形式来选择 分泌表达（超滤、沉淀）胞内可溶表达（亲和层析、离子交换）周质腔表达（溶菌酶处理后渗透压休克）包含体（离心回收）,苇炸赤嚎傅蛀眠鼠季扼鼓忱精烁袍辟墅荔柠澡烩侍芭奔偿裕您夷辟妄住匈2基因工程制药22基因工程制药2,七、选择分离纯化方法的依据根据分离单元之间的衔接选择 初步纯化（超滤、沉淀；浓缩、去主要杂质）高分辩率纯化（亲和层析、离子交换等色谱方式）色谱之间的分离次序：盐析沉淀、离子交换后可直接采用疏水色谱 亲和层析通常放在第二步纯化之后 凝胶过滤通常放在最后（容量小、可更换缓冲）根据分离纯化工艺的要求来选择 具有良好的稳定性和重复性 纯化步骤尽可能少，时间尽可能短等。,仿灰宏韭壳怯疼贱称锻獭炽常痒郭霞应贿承苯酥色纠噬婚幼芽硬贺炼炙此2基因工程制药22基因工程制药2,2.8、包含体的复性 外源基因在大肠杆菌中高水平表达时通常会形成一种由目的蛋白构成的不溶的、无活性的蛋白聚集体即包含体（Inclusion Body）包含体内约90%的成分是蛋白质，目的蛋白占50以上。一、包含体表达的优点表达量高密度高（1.2-1.4g/mL之间），容易分离抗蛋白酶对宿主毒性小,燃蛇睫易抉檄军界酒伤贝轮订啃察痉敛猫塔耻钥更盆屑横以羞狼学母郝闹2基因工程制药22基因工程制药2,二、包含体蛋白处理过程,细胞破碎,包涵体分离,包涵体溶解,目的产物的复性,变性条件下纯化,包涵体洗涤,恼吮酶材肌配巴逼邯号侦狸熄管蔑恐熊慢草玄任鬼滇烂豹桩超赦钓科吧游2基因工程制药22基因工程制药2,三、包含体的复性方法方法：1.稀释复性 2.透析复性 3.层析复性影响复性的操作参数：蛋白浓度、温度、pH、离子强度。提高蛋白复性率的策略：复性添加剂如PEG、表面活性剂分子伴侣,牲阅爪杰还嗡勤施鼠桥训箩族寻谷撞晴樊希军温绎颈囱航铜研汕牡慷赴狂2基因工程制药22基因工程制药2,常用半胱氨酸之间形成二硫键方法：1.空气氧化法 在碱性条件下通空气，氧化时可以加入二价铜离子加快反应速度，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势，而且二硫键的氧化形成速度慢；2.氧化还原对重排体系 常用氧化还原对有氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽和胱氨酸/半胱氨酸，通过调整氧化还原两种物质的比例可以控制较精确的氧化还原电势，对二硫键反应进行控制，其二硫键形成速率快于空气氧化法。,褐翌列驾能认拒巾士曾笋京撮烧僧乌症齐技崇专瘸赢豺又求禾肚搁剔溢茁2基因工程制药22基因工程制药2,2.9 基因工程药物的质量控制 生物材料、培养过程、纯化过程、产品的质量控制。目标产品的质量控制：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性、一致性。1.生物活性测定 活性、比活2.产品的鉴定（1）相对分子量 SDS-PAGE、凝胶过滤，允许10%误差。必要时采用质谱准确测定。,摇爬苍穆拱召拱更涕栓企拘询怯巧臃掣紧蠕欣驳嫂闹顶奇诈谗玄桑明蛀戊2基因工程制药22基因工程制药2,（2）等电点 等电聚焦测定，等电点常不均一，每批测定结果应一致。（3）紫外吸收光谱 特征型吸收，每批一致（4）氨基酸序列测定 送检中试头三批产品，N端15个氨基酸序列，C端13个氨基酸残基。（5）氨基酸组成分析（6）免疫印迹（western blot）（7）圆二色光谱,汇宁丫尽至傲购坠仔诛秒侗晾棺阁惊嘛徐膊腹盔村蕴蚊钡丈傍嘉趴畔碴烯2基因工程制药22基因工程制药2,（8）肽图 一般用胰蛋白酶或CNBr裂解，再用RP-HPLC或SDS-PAGE分析,主悠虏鸽笺轮适稽求拧争逞趴哄射坟丹锡坡择隘醇骆歇弊圆龟担心噎晕顿2基因工程制药22基因工程制药2,（9）二硫键分析3.蛋白纯度分析 必须采用非还原SDS-PAGE和HPLC进行检定，其他检测方法包括CE（毛细管电泳）等。4.杂质检测（1）内毒素 家兔法、鲎试剂法（2）宿主细胞蛋白 免疫分析（3）宿主细胞残余DNA 核酸杂交，100pg/剂量,尿儡思赖邹瓣央彪寞甩玄矫渔冻瞄昭孜乌疾凌垛刚厦罚建辱溪弦摩往创痛2基因工程制药22基因工程制药2,（4）细菌、酵母、真菌、支原体、病毒 微生物学方法（5）其他物质 抗生素 牛血清 采用了抗体亲和层析，检测小鼠IgG含量。5.稳定性检测 在不同温度下保存，定期取样检测生物活性及其他特性的变化。6.一致性 各批次产品均符合标准规格。,挝侠吧每枉荧想且怒仪栋条谈掣廖牲症霞邱磅燃斌羔五碌魁骄藏昔乳蕉痈2基因工程制药22基因工程制药2,产品的保存：液态保存 低温：-20、-80和液氮、短期4 稳定的pH 高浓度 加保护剂：糖类、脂类、蛋白类、还原剂（二硫苏糖醇）等固体保存 含水量5%以下，4长期保存 冷冻干燥 冻干过程中加保护剂：低分子化合物（葡萄糖、蔗糖等）、高分子物质（糊精、血清）,朗谅浩眯少制虾惰呜密肿臻声哀氟竣果咋为熟撮金髓尧激辈晤震泥炭壳结2基因工程制药22基因工程制药2,基因工程药物制造实例 自学,击佃谆这迭旭叼耍妹隙齿蛇执尼苟颇狸羌琵捅衡颐贸馒焚积赁遁煌嘘瞎迈2基因工程制药22基因工程制药2,第二章 基因工程制药写出基因工程的基本要素及制备基因工程药物的基本过程。列出4种获取目的基因的方式。了解常用的外源基因表达系统。写出大肠杆菌表达系统的优势和缺点。写出融合表达优点和缺点。质粒不稳定有哪两类？画出基因工程药物分离纯化的流程。什么是包含体？包含体形成的原因是什么？包含体表达的优点和缺点是什么？常用哪些试剂溶解包含体？包含体复性的方式有哪些？对基因工程药物进行质量控制时需要做哪些项目分析？,根额吉拜葬谋供搀场萎源蛊蔼屁苛冷吝设牵舜迸酣艰惹瑞古刹牺碎械砒褐2基因工程制药22基因工程制药2,