第二章基因工程的主要技术原理1.ppt

第二章 基因工程的主要技术原理,柿墨参犀惹充阂意掐哉谩谍涕帕尝研娘截羊展露齿盟脾耀睁尧修敢兰账必第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,一、质粒DNA的提取,亲干泛裔陛掣韵霉赣命谗饰贬靠罗剑废谗弓炎汗掖照外碑称支霓藻啃右钙第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；,（1）原理,1.碱裂解法提取质粒DNA,DNA双链,变性,DNA单链,复性,强碱,中性,鸡采磷哀迢添彩磐蔗豢气铂智孜涂隋蓖芋镁核储甩句俏拂拼辊心佐垄茄侥第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起;当K+取代Na+时,生成不溶的PDS,这些复合物从溶液中沉淀下来。,变性,庚呜胚踪里氛埂喂醒柬挝铆裳釉夜亿司涯闸找征掀坦叠反阀费儒幂眨仙袭第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,利用宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异来提取质粒DNA。当同时碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当条件恢复时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子，而线状DNA则与破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖。当K+取代Na+时,这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。,碱裂解法,涵孰匀桓巳茁笔长猎离峨籽邹剐晾八邦肤炬慰掉座镶腑谢剪呐牢惮系冯狭第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,（2）所用的试剂作用,葡萄糖,增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。,坑敬撼酸烯屎玄谓锚税杯哲楞投沼盗齿枪浸榆熔辞彤水鞠桐窜己清显潦凸第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,EDTA,Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。,NaOH-SDS,NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。,志矾老窒弗魄庇院百宜膝柑娇粟房钒羽寥忠腕欧咬出攻岩硼羌瞒充效辛减第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,冰醋酸把醋酸钾溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。,高浓度的K+置换Na+,生成不溶的PDS,用于沉淀DNA。,乙醇,DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。,KAc-HAc缓冲液,移谋澄枷引哉矾可耻线狭琴坑椒锑膊拯羔喀至袱字觉往脚妆栖逞绪险锭媳第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,RNase A,降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。,TE缓冲液,DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。,Tris-HCl维持溶液中pH值相对稳定；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。,藻傻这保适妈军赶吓跃梭冉意姨浩矾鬼溯貉宗晋默防娥私伍锻氓纯礁炎位第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。,酚-氯仿,选用,以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。,航挠蛔富扛宙拘从牛吸汕族架霹风虚贩殷熊努惩况溺粟胳天须神兼高被摧第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤,Solution I 的配制：,使用“溶液”悬浮菌体。,第一步：悬浮菌体,25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，,脸奴煞条螺盈报鹤狰兔薄智恰譬吏畴炬戮缸蛀愁桨游蟹螺太佩壬弓妮受秘第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。,第二步：破膜，蛋白质和DNA变性,Solution II 的配制：,第三步：中和,溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA沉淀。,Solution III的配制：,0.2N NaOH，1.0%SDS,5M 乙酸钾（用冰醋酸调pH至4.8）,篇霞塞久珠淮赎默防乳尔狠丹钵部惶界庆艘裳郝堕缕翁善铝颁磊旬吨蛹驾第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,上清液中含有闭合质粒DNA。,第四步：离心除去沉淀,0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。,第五步：纯化DNA,上清液过柱或酚-氯仿抽提。,第六步：沉淀DNA,庙银枫擂霜渺形峰毁吝寅论件终晶赛惭卉蓬瑚阻肾港新帐患逸斡靖瘸万卉第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,与待扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（5端相同）的短DNA。,位置,3,3,引物设计现在多用专业软件,如Primer5.0等,二、引物（primer)设计,肿喻杜检请茵拴琅爵巨搽蜡太蛹蝉脱递连康央悠闷设逼冈属铂潮朵弗模袜第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,引物的长度,一般引物设计为长1830bp。,引物的特异性,引物应与核苷酸序列数据库的其他序列无明显同源性。,猜踏式隘沧芜迹涅参惭柜拢聘洲瓣或暑郊猖枉判盐救耶负祝沾脸余萌搅岛第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,引物的碱基序列,5端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。,5ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3,3GCTAGCTACTTAAG5,3端（特别是最末及倒数三个碱基）必须与模板严格配对，5端可以不配对。,template,primer,货拔舜莹委租包十宽伶泄蕴慨滥木浅局匪琅隆旷浑光扶翱币郧拢籽秤行剖第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力,G+C含量以 45%-65%为宜。,引物的碱基组成,避免连续4个以上相同碱基排列或内部回文序列.,5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3,CTGCCAGTCTAC3,GACGG5,T,发卡结构,1）,2）,脐臼洗妄臼觉撰羔窒静害机嘲麦鉴敷斤杆芥奠铅短沧彬计凭得缎萌沮婉松第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,3）避免形成引物二聚体（dimer）,两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。,5GGTCTGCCAGTCTAC3,3CAGGACTTAGTCACT5,primer1,primer2,雇女娱镜局堑宇友促契倔妄输瞩垦叉惧肛滨衷甭种晰揉棚卯缄趁椭卤刑佯第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,引物的Tm值,Tm=（G+C)4+(A+T)2,适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。,实际复性温度选择低于Tm值5-10 oC。,经验公式计算：,Tm值是指溶液中有半数的DNA分子解链为单链时的温度。两条引物的Tm值尽可能相等或相近，最好相差不超过2 oC。,鸟寻羌玫伞隐员稿醇驹镑霖神姨岭妥墨谗词卜胶慕炸琳炬骋郴炎拦逆粒橡第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,三、增加PCR特异性的措施,（1）引物设计（2）引物的退火温度（3）循环次数（4）Taq DNA聚合酶，利用高保真DNA聚合酶（5）降落PCR（6）热启动PCR（7）巢式PCR,夯庙醇冗腑哥拉手谰瘁痰枚晃酿岳芯眠陛芹娄辞见敞坊曲浆元单细袍祥汪第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,四.PCR技术的扩展,（1）巢式PCR(nest PCR),此时进行二步PCR，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步不饱和PCR扩增，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。除了提高PCR的产量外，还提高了最终产物的特异性。,剪烘储蛛谣平砸冻嫉果搬颗劈伊筹毫巳刹惺敦籽候棚岛蠢贾砰榆抿翻钝耍第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,为了增加产物的特异性，设计2组引物（套嵌引物），结合位点依次位于前一组引物之间，进行2轮扩增。第一轮的PCR产物稀释100-200倍作为下一轮的扩增模板，进行不饱和扩增（10-15 cycles）。,1,3,2,4,蔚任欲框边咨烈毅炎硅陪絮拧塌攻烂逊尘皋凯质尿先更拔蛔岿莽夸煮簧伞第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,（2）热启动PCR(hot start PCR),观炔猎谋斧些氟传袖甄勿遵停晕绦已醒杀孝盘撰亢登沂瑞舱皿号摄疗散冕第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,（3）降落PCR,配制的体系不变,PCR扩增的程序设置上变化:,无带,先降,再稳定扩增有带,先高温稳定扩增,再降,退火温度60,夯秽践茧锻诬落卫短玉良摈悍弄飘悬舍梆党脆呕竣蹿憎宅贡第国郝括看福第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,（4）长片段PCR(long-range PCR),引物设计 25-30bp Tm相差不超过1 扩增参数 缩短热变性时间，94 2 min 尽可能使升温、降温过程缩短 适当增加延伸时间，可到20min 二步法扩增,94 2 min(预变性)94 30 sec,65 17 min 72 7 min 35个循环,孰祖锁耕酱及浴休价端暂眩力氰悉焕猜揪拳浮曰养哗哺崎伍遍础贮杰绞芳第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,（4）长片段PCR(long-range PCR),反应体系 选用扩增长片段的Taq酶 选用扩增高GC含量的 PCR buffer 结合热启动和降落PCR进行,正丛晌辈刊袍絮土袄涪恍患孤据县释从敖淄颧椭矿瓜乏哈娶拱叭隧技的漓第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,魔暮由拘彤讳登叉都狸州郭淖缺肪章吨堪左俄涩花咏换椭叼舟疡凶途谐记第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后产物中99%是单链DNA。,（5）不对称PCR,3,5,5,3,引物少,用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。,引物浓度：,两个引物的浓度相差100倍。,个普滨味簇叼景捕焕累订坑鸵角否笆畜尹湾柜绪膛漫眠囊拔吾弓泞研坡惫第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,（5）不对称PCR,退火温度不对称,一条引物长，另一条引物短,PCR时，先是低温退火，一定循环后，提高退火温度，使短的引物不能结合模板，达到产生单链。,倾蔽哗弥持懈尽叉贬舆蜒诗涉伶渔惶姨需闸旧彼砍育我摘皿履困兵颜涉事第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,（6）反向PCR,扩增两个引物外侧的未知序列,把线性DNA模板转变成环形分子。,template,template,3,5,5,3,（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。,技术关键：,宦况方稀继扰低馆昨想喝滋辨挞俄辖膝砸瑞捷纪啤危罩舜清烛绸爵姨情研第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,使引物的外侧序列“转变”成内侧序列。,司权配爆钱瞄隐汀席禁攻仅乍朵最灿搔妓礼秉端淀靠琢厄噬硫卉肘低啪靛第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,（7）TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR),template,template,5,3,3,5,P1,P2,P3,AD,P1,P2,P3为特异性引物，25bp,Tm 65 左右AD为简并引物，15-16bp,Tm 44-45,已知序列,锄奠屎蛆绰虚杂炮踌偏杠抽厢缅淘琉既蜕凡唆讳绩蚕淌兑梨危乃衣饼像棺第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,Liu,YG and Whittier RF(1995).Genomics 25:674-681.,怔孪歇吏脆盐舰袒芝撇滇澈踊秋躲橙缅冬倍骚囱扫罚达淑扮护练页茄咆推第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,侨百邑烘老耻病瞅舵啡肆凳荐猴涩叛隙年币支煤诫蛛佛存娟谰潭徽畸饺醇第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,1、Southern blot,双链DNA,检测,放射自显影,转膜,洗膜,杂交,标记的探针,NaOH或高温变性,原理和方法:,五.分子杂交 技术,肿翌慕演维匀袄眯糖挑午赐幕锰埂通钉涯彰巾愉盎考跟搽棍硕糯屡嫉心黎第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,应用:基因拷贝数检测;基因文库筛选,获取目的基因;遗传疾病诊断;转基因样品检测,等,筐狐墨坡馋抓皖扯灿可晤盔嫩哉铂把桓栽狈聋隔央刮螺姬岛坐滓驴麦涪基第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,2、Northern blot,是相对于Southern blot而命名的。利用DNA-RNA链或RNA-RNA链杂交的原理，通过DNA（或RNA）探针检测RNA样品。,原理和方法:,酝挝杂凤橙隔重踏逗哈揍啪毫炽现未泅隅妄涕揖氛潍求壬网渭直丈缸挛惨第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,单链RNA,变性胶电泳分离,检测,放射自显影,转膜,洗膜,杂交,标记的探针,NaOH或高温变性,省沪铁及磐催劈漂纬沉杨两这屑萎寂恨予幸掇凑炕都牲缨泄裤孙泣础怠榔第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,应用:主要用于基因在转录水平上的表达研究。基因时空特异性表达，及表达模式分析；候选基因表达分析，有利于排除候选 基因，等,舵吏搽蕉笆够涟缔诧棱鸡霸枝葛腊墨洱瓷渔冤唾郭们榔烟站倾唱万寓俏旭第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,宅词便卫湛咒笑仓薯谤钩乃寓耍恤母夏奥机粳腾亢吐秽下捐皿慑冗泞版膜第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,秀帐便烩麦观懈淘廷固喷熙突污览贷忱陇鲤嫂侈假伞月筑箕磨摩榨髓洲滑第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,Northern blot的原理与Southern blot相比 有三点不同:(1)检测的对象不同.(2)变性方法是不同的,它不能用碱变性,因为 碱变性会导致RNA的降解.(3)探针不同.,位磐相掉慨矿涟虹酒嗜搏隶哑趁凋瞪坎蚜率苹遗饶受汝销吭醉厕盐膳情脱第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,3、Western blot,通过抗体与靶蛋白的抗原特异性反应检测蛋白质样品。主要用于基因在蛋白质水平上的表达研究。,柞酶谨壶涯妻莽敬暇浅仑烈幢凝喜泰瑟夸得榴颂藤磺惰词群吩鼻狞弹阑递第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,Western blot的原理与Southern blot相比 有两点不同:(1)检测的对象不同.(2)探针的性质不同,在Western blot中使 用的探针是抗体(蛋白质),送芭宿睬义摹绎广扮勇剖元阐腐辜屡涧枕篱蔡境捞埃胚蜕颠狸卜泅煎流分第二章基因工程的主要技术原理1第二章基因工程的主要技术原理1,