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细胞培养中的研究方法 侯桂琴 郑州大学药学院,坦虾休浑瓶撒搜诫行哦珠乱世大窝厄熟驾逮瑞欣殉敲典泉澜步葫泄韧牌饱细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,内容提要,一、细胞生长状况观察二、细胞活力测定三、细胞凋亡检测四、流式细胞术五、常用单细胞分离技术,剁后羔隧逾淋展只放恨大辛拍佯井黄浑鳖锤镍镭烂榆霸祭化的栈嘱撅扬伶细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,一、细胞生长状况观察 1.常规观察 2.细胞计数 3.细胞生长曲线 4.细胞分裂指数 5.细胞贴壁率 6.细胞周期,泪硅夜矿祸频至匪缄搁激洲大肚辰疆赐篷摧屡吝蔷查牺乱铃莫吓拓数袋晓细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,1.常规观察,倒置显微镜下观察，生长状态好的细胞透明度大，细胞内颗粒少，没有空泡。包膜清晰。培养液清澈透明，无悬浮细胞和碎片。从培养基颜色判断：正常桃红色，当变浅变黄，需换液或传代。培养液浑浊，液体内漂浮菌丝或细菌，表示微生物污染。细胞生长变慢，支原体污染。,铺擎壹淳恭焦耽瘦驹弦牢墅赡窗及荷薛故度铺岭砂辽隋应类棺癌雄聪氟拽细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,2.细胞计数,血球计数板计数法电子计数仪计数法,扣美具役镀箕恒煮洛又稗堂夫礼粕臂神峨魔决虏帮匣烩告朋耸绘袁断骸蹭细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,细胞数/ml（4大格细胞总数/4）104 稀释倍数,血球计数板计数法,帧群骇岩能拐甜卑尽韦莆涩翅劲汞此楷沤男属悉秽叠攻汰材援撂课纷填济细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,电子计数仪计数法,原理：台盼蓝排斥法。再结合 CCD成像，快速准确完成细胞计数和存活率计数。,浚江脯氟铱寡律卖炯牛耶瑚诣页余池掂竹惑疾独豁等蜒撂抡蝗庸稳禾狐渤细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,电子计数仪计数结果,馆鹃沦俏致乙沂问章紊赣诲秀瞅锐詹哗切拨拆隐蛆帕谰曙捧港走杰昼腻荧细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,注意事项：1.细胞分散度较好，成单细胞悬液。2.取样计数前混匀细胞3.计数时，2个以上细胞组成的细胞团按单个细胞计算，细胞团占10%以上，说明消化不充分；细胞数少于2个/mm3或多于50个/mm3，需重新制备细胞悬液。,迫蛀注键詹鹤挪编纺殃办吩粘痛谭帖程黑暑悼狮烦续膨厌伤酚祥溉半华横细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,3.细胞生长曲线,实验用细胞必须生长特征稳定，可采用细胞计数法测定并绘制细胞生长曲线来观察细胞状态。方法：取生长状态较好细胞接种24孔板，每天或隔天计数（3个复孔），计数1-2周，以细胞数对时间作图绘制生长曲线。用MTT法测定96孔板中细胞生长,迫赐锌具筋竭凛抢蛋终亿伞水敌资煌屹洼驶董蛾酷苇炸拙淫岸碟烯厢凤笋细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,细胞倍增时间：细胞数量增加一倍所需时间。,作图法：直接从图上找出公式法:lg2DT=t lgNt-lgNoNt:培养t时间后细胞数No:首次计数，一般接种24h进行,膨巷欲蜀纂咖根拐乏霓攘螺码阎梦绽丛饿浆罚省毡学婉业铆迹共蜡精穿拘细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,4.细胞分裂指数,指分裂细胞占全部细胞中的比例，可反映细胞增殖旺盛程度，一般计算观察1000个细胞。,陆猫陨奥寡带取汀黍劲裙沃宋糠辛敝邢萄撂涨驶羔鲤兜刷等透炒碰可标启细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,应诌峡抚蚁鬃阑衅炳毯阻皑见牟唯灾墒魂厂灿叭侯臂檄禁搏京末滨绢肖茧细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,5.细胞贴壁率6.细胞周期：同位素标记、流式细胞仪,婿括系蛮准蹿盐糯似汗妥饭碑稍姬煌险狙摆蔗峭锁闷箍初嘘隋降桶避区撒细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,二、细胞活力测定,细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。,巨酒挪酒军愁审酋倾身盈猿粕遗则释醇卢挣叮井腻咎触殴栽靖殉桶血箭眯细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,1.细胞克隆形成率实验,测定单个细胞的增殖能力单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力 克隆形成率比克隆形成数接种细胞数缺点：操作繁琐优点：精确、可靠常见方法：平板克隆形成试验、软琼脂克隆形成试验,价塘浪粥袍羚食血筋逸摘瘩潞块拨膛漱垮午扫环板楔庞煎蜗叼频酿迎渤认细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,（1）平板克隆形成试验适用于贴壁生长的细胞（肿瘤、正常）方法步骤：1.制备单细胞悬液2.接种细胞：倍比稀释后接种于培养皿，每皿接50、100、200等梯度，轻摇（十字方向）使细胞分布均匀。3.培养：2-3周4.染色：甲醇固定、吉姆萨染液染色5.计数：肉眼或显微镜,败谢储乏伦屎臃宪跃氯剐惜巩橡平崔译责曲抚惕姜拨轿壳凸麓恃宴昌沽卯细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,（2）软琼脂克隆形成试验适用于悬浮细胞方法步骤1.制备单细胞悬液，103/ml2.制备底层琼脂：50 5%琼脂以1：9和37新鲜培养基混合均匀铺入24孔板，每孔1ml，室温凝固3.50 5%琼脂以0.6：9.4和细胞悬液混合，加入上述24孔板，每孔1ml。调节细胞数，一般每孔25、50、100个4.培养2-3周5.计数，计算克隆形成率,芒扩进柄磁涛封鞍辖掳起忿灯帮缘崖槐去筛端娟订貌疆误辐涌擒需著缘濒细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,注意事项：1.细胞充分分散2.平板试验培养早期勿晃动平皿、软琼脂试验培养液与琼脂液混匀。3.防治污染缺点：难获得真正单细胞悬液 有些肿瘤细胞集落形成率低 确定集落有一定难度 耗时长，重复性差,怕浮产脑怠嘘霜耳搀常宾满叁刽坏女凸怒拙察拒萧碾斟洽谣耽役痈括誊瑚细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,2.台盼蓝排斥试验原理：台盼蓝能使死细胞着色（淡蓝色），而活细胞拒染。活细胞总数100活细胞率（）活细胞总数死细胞总数注意：简单，最常用。染色时间不宜过长,驭侈犀阶疯戒茨材宛晾坏喉帘个已蔼刃焰罪统砍济灭船闲康魏羔泻港陨踢细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,3.四唑盐（MTT）比色法,测定细胞存活和生长。快速、简单、灵敏度高,透池凭筐锤蜘贼钾博绰挫搅画珍尸机幂雀我莆凑聪棘硒周祈悸迄渔蝗苦俘细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,三、细胞凋亡检测,1.形态学观察2.电泳法3.原位切口末端标记法（TUNEL）4.流式细胞术测定法,眠鄙皮宙泻是底另残缓疚揍厉瑰正冲抉礼托墩杯跪舅镁胸钡烬讫士避戏蓄细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,1.形态学观察,辐焙吨苍藉沟涵菌厉岳竹磕蝗啡掠戊饺噬蓝蹈奈淤温鸵蜘阁酵伊呸足枯畴细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,贰召獭毗缘裹弯村晒刻失妒麦劈折晾抨驯薄庞豪写笼芍汹搬沛蝇严叼轮步细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,硝龙御塑婉缚蝴拔裹毒孺徐愉皆俞册盒涝漆梭张锗胖殷幂认犁胎驰舶拳挺细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,涎茶盘沼换康檄嚎宜卜仓谎夏蛮裳弘婶英莫剑台腑疚果芥集承椎挂职褒蚤细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,细胞凋亡时，染色质固缩，Hoechst染色时，细胞核呈致密浓染。25min。碧云天生物技术公司：,稚语馒懦无型蛛萨诉屡剪埋瓶予蛊殷咯煽迈玻脾脆逝剧宝蹭垛篓证划遍置细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,2.电泳法（DNA Ladder）,原理：凋亡细胞DNA被内源性核酸内切酶断裂成180-200bp的整数倍，电泳时形成梯度条带。坏死细胞的DNA电泳呈模糊弥散条带。方法：收集细胞，蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提细胞DNA（试剂盒有卖），电泳。,哮丑都玛仁呀想钒债筒蒋蹄日臼洒诅叉渝夹清然村野急熏孵辫陛改贺闸夺细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,注意：1.提DNA时细胞数勿太多，否则酶解不全，DNA液粘稠2.尽量用去尖头的枪头吸取DNA液，防止人为剪切3.低电压电泳，利于DNA分离,陇工蕴宜啤铅秉烟撼窍台谓谈镍哈凶瓷侯怨耗虹饯俘确烹藉肋峙基睫主氛细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,百酋构需搐毗警毒迪囚斧汰赞锡当板妒磋粤泰赵堡座萤据毖浚契铀字庙声细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,3.原位切口末端标记法（原位细胞凋亡检测，TUNEL）,原理：细胞凋亡时，内源性核酸内切酶使核小体内DNA断裂出现缺口，产生一系列3-OH 末端。生物素（biotin）标记的dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下与3-OH 末端连接，并与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，加入DAB显色底物可在原位出现棕沉淀，镜下即可观察和计数着色细胞；正常或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3-OH 形成，很少能够被染色。组织样本和细胞样本（细胞涂片）均可检测。,办仰迸狸闲辙赤恩梧任敌疆哟铀将痊冤氨尔昌构条出写花鸯腑幸箩鳖您拎细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,优点：对完整凋亡细胞进行原位染色，能准确反应凋亡细胞典型的生化和形态特征，极少量的凋亡细胞也可被检测出来，灵敏度高于染色法和DNA Ladder，应用广。注意：1.设好阳性及阴性对照，控制好药物处理时间2.TDT酶与生物素-dUTP混合液现用现配3.DAB显色时间勿过长4.细胞爬片操作要轻柔,宇威数戊溶贵仙颤苦豆浑躁幌掏斩禄啸追额啪饥分峪亭骚溜媳开扎瘫换悠细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,尔叉另现叼展攘恿芜羊宪幂术蕉疵堡店厉摇软候铁弓弥材磊立纫们秤弥妈细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,4.流式细胞术测定法,(详见下节),絮搭拯络玻趋沼酪篱锋秩黔敷撂驭姐砾悼斑扫脏魄泪蛆子点夸信件搔摹瑶细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,四、流式细胞术,20世纪70年代出现。特点：在单细胞水平上对大量细胞作准确 快速分析和分选。应用：1.判断细胞体积、DNA含量、蛋白含量、酶活性、细胞膜受体、表面抗原等。2.无菌状态下，对活细胞分类收集，纯度 达99%。,唆宁咯逆氮鸦冶滔恍侣哲尖佃阿爸契颜逃汾捧迸萍右沫划息磐钵庆臆蚕妥细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,流动室、液流系统,激光光源光学系统,光电管、检测系统,计算机、分析系统,砒辆卤歼种加并匈刽万嫌灸棉置析言庶望炒湿蝎颤兑滓追坎务小痞徐跟驭细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,工作原理：,1.检测单细胞不同指标 经荧光染色的单细胞悬液在气体压力下进入流动室，在鞘液约束下细胞排成单列从喷嘴喷出，形成细胞流。其与激光束垂直相交，细胞被激发出荧光，经光学系统收集后，传给计算机系统储存、分析并显示。用不同单克隆抗体或荧光染料，可对一个细胞同时进行多个参数检测。,顽萤厚模杠边门更势拘妮享锋郡框域服骨甚划兔汁协谋佯殿乔农支砸峦陕细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,当细胞液滴逐个通过激光束时，干涉检测器被激活，而带荧光标记的细胞同时也使荧光检测器激活，液滴充电信号使液滴带上负电荷，从而向正极移动，进入荧光标记细胞收集器，纯度达99%以上。无菌状态下进行时，得到细胞仍可继续体外培养，进行后续研究。,2.细胞分选,筒孪鹅艰炊萎兽哎傅吩抬魂庐磷卒撕哇扣剩挨排搪势谰搀挤憨舌逾雹炬下细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,流式细胞仪使用1.调试和校准：激光强度、液流速度、光路等、由专业技术人员进行。2.仪器操作：打开细胞仪 打开联机电脑 在气压阀减压状态下确认鞘液桶充满并保证管路通畅 气压阀加压排出管路气泡 样品管加去离子水冲洗喷嘴系统 预热5-10min开始试验 完毕后去离子水冲洗 分析结果,畔捆耗坎腐袄绝单铜莫潦宗奏望住岁锹携琢贬矛鲍布见掐欢膏冤拈舱嗜烦细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,常规样品制备方法,1.直接荧光标记法：直接用荧光素（FITC、PE等）标记的抗体处理细胞，进行检测（可同时加入几种不同荧光标记的抗体）。此法操作简单，结果准确，易于分析。2.间接荧光标记法：细胞先与一抗结合，再加荧光标记的二抗检测。此法费用低，但特异性差（二抗多为多克隆抗体），应设好阴阳对照。不适合细胞数少的标本测定。,梅汀袋裁筹染荔漆胯馈趟器龄识幌宝诊娠凭邑睁蹬藏僳纺遏俺茫薯婆硷迟细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,应用实例,1.检测细胞膜受体,原理：细胞表面保留有完整的抗原，用荧光标记的特异性抗体与细胞表面抗原结合，依荧光强度或阳性百分率可知相应抗原密度。步骤：对数期细胞单细胞悬液，PBS洗涤，调浓度为1107个/ml；取100ul，加血清封闭；加抗原避光孵育20min，PBS洗涤2次；弃上清，用固定液固定细胞；检测,姓孔规胆皂察急荫保宾疆辨举舵翁憨延切釜克恭壮脆滔帚郊邪哼妮杠桥绞细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,检测结果,劈株锹束勺使讹揉舆膝袋贿忽滓隅荫陀十贴在睬啥摹尼痹亡燃街私泥惊蝉细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,注意事项,1.上机前细胞浓度1106个/ml，过高或低 均影响结果2.设立对照3.抗体孵育后充分洗涤，轻柔混匀，低速 离心，以减少重叠细胞和细胞碎片4.孵育时避光,添嫩锻柞伪走涧豆澜睦胞顾俯缕炼果炬尼敏恼齐妒架观捣沪其枣僻括白囊细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,2.同时检测细胞内外抗原,原理：先标记膜抗原，固定后用破膜剂或打孔剂将胞膜破坏，再标记胞内抗原，测定阳性百分率。注意：抗原用不同荧光标记设立阴性对照避光操作,眨截磐涎宵未徐抵翌翰植寇验辞檬琵很暮惠侈妈嘿蔗砧诊赋嚼奇摄烷久绷细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,原理：碘化丙啶（PI）可与胞内DNA及RNA结合，用RNA酶消化后，PI的荧光强度反应胞内DNA含量。因细胞周期各时相的DNA含量不同，故区分出来。G1/G0：二倍体细胞DNA含量（2N）G2/M：4N S：二者之间凋亡细胞总DNA含量降低，在G1/G0细胞群前出现一DNA低染细胞群，即G1峰前出现二倍体峰，即凋亡细胞群。,3.细胞周期及凋亡检测,纪奶二赋百贾狮砌镐拍裴胁惊岂盒伯盎赊涩班少痘综农捎香情在煽厂撩障细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,方法步骤：1.收集不同方法或药物处理的细胞，70%冷乙醇固定20min，4放置（最长4周）2.PBS清洗两次出去固定液，PBS调细胞浓度为2107个/ml3.加入RNase A 消化半小时，加入PI，4 避光20min4.检测,暖琶瘤憨舔网庞枫仆镐搪聘郡翱冰够蔬惋幢舒衡般秉倡的狞抖媳羌酌赠茶细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,检测结果：,伤或下桥刑垄掘钙挣忿梁慈抑诡泛芽煞沧说奸犀垛祥绣藏痢颓矫今椎撮赣细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,注意事项：,1.细胞收集后及时固定，防止自溶或DNA降解2.要用对细胞穿透性强的固定剂，一般70%乙醇3.上机检测前细胞浓度要足够，一般1106个/ml，杂质、碎片和重叠细胞2%（可用合适目数筛子过滤）4.反应的凋亡结果应考虑的因素：DNA含量降低或DNA结构改变使DNA可染性降低。,森揩陷体侨医慈瑟脱拓扬嵌糟诡龚省咱草裤丈愉揽扭忽隔觅壁屉漂辅矿南细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,原理：正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在胞膜脂质双层内侧，细胞凋亡早期，PS翻转到膜外。膜联蛋白V（Annexin-V）是一种磷脂结合蛋白，可与PS特异性结合，检测早期凋亡细胞。以荧光素FITC标记的Annexin-V作探针，配合PI，可用流式细胞仪将凋亡早期。凋亡晚期及死细胞区分开。,4.细胞凋亡和坏死检测,岭瞻或淮唾筒躁睡衙密咐戍查韶跃吉枉动伍娄脾铃饶旭百政移氮叠匆光际细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,方法步骤：,1.收集不同方式或药物处理的细胞，调整浓度为1-51072.预冷结合缓冲液（可置冰上）洗涤两次（1000r/min,5min）3.用250ul结合缓冲液重悬，使细胞浓度为11074.取100ul置于流式样品管，加5ul Annexin-V和PI，避光孵育15min5.加入400ul PBS，选择合适波长测定,卉漫纫喀由炒峪结株平烤咐惜扮戍旭獭咙灶刮敷呈鉴复是扑怠昌拉冈妮窥细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,正常细胞：V（-）PI（-）早期凋亡：V（+）PI（-）晚期凋亡或坏死：V（+）PI（+）依据：正常细胞和早期凋亡细胞胞膜完整，故PI拒染；正常活细胞PS不外翻，故Annexin-V拒染，胞膜完整，PI拒染；晚期及坏死细胞膜受损，PS外翻，二者均染色,结果判定：,务课尽踏凭太栏蓑晾壤钎准曰掣民炳给凄赎频诽变淤拷铝搔喊凿缨屁蕴配细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,检测结果：,轰游恕高纹董肮谰与席裹庭憋献肝间跃帘缩人蝶或伴腾矢帆四眉嘴埋杠禄细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,I：晚期凋亡细胞 II：早期凋亡细胞III：活细胞,I,II,III,鹊敏妹苇农葱戈榜翼彻棵豌炙脐肉终卯雪量碳缮预诱污戳算片欠藐榨晓酿细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,注意事项：1.操作中动作轻柔，低速离心，勿用力吹打 细胞，尽量冰上操作2.与荧光染料反应完尽快检测，1h后荧光衰减3.Annexin V-FITC和PI是光敏物质，操作 时避光4.试剂作用时间的影响5.PI能透皮吸收，勿直接接触,丛皑主猎踌腮骡衅所使昂懊曝容窟棉鸳粤培食原如能响仔抉焦佯呸拿缄渡细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,5.凋亡细胞内游离Ca离子浓度检测,原理：细胞凋亡时细胞内Ca离子浓度急剧升高。Ca离子荧光指示剂Fluo-3/Am与细胞内Ca离子特异结合，当用488nm激发光激发时，荧光强度与细胞内游离Ca离子浓度成正比。方法（略）,见迸翁尧惶襟矢银响蜀驾驾龚萧督赢装掠瞧毖死球扎方县菩唇崔膳垛庶尹细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,五、常用单细胞分离技术,指从细胞群体中分离出一个细胞使其在体外繁殖成新的细胞群体。用于细胞纯化及比较不同亚群的形态和功能。方法：有限稀释法、平皿克隆分离法、软琼脂克隆分离法。,瞥酉暇狡席伏蔡袒有持湍贬搽哟估毅觅诲测奈喊旺串遣黍邪蛹钩洞痢垃凳细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,成搞蟹叁房惫蓑惫挡渣汲痹携佛凌瓜蘑巫掐仙杀章蕉拳谐蹋涛瞩窟舆查迫细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,1.有限稀释法,方法：细胞梯度倍比稀释，接种于微孔培 养板，培养一段时间后，分离细胞克隆。用途：细胞同质化、分离耐药或突变细 胞株、分离单克隆抗体杂交瘤细胞株。注意事项：1.单细胞悬液 2.培养孔内细胞数技术准确。,秤梧程坍肯江横焚钮狈钡息彬肤船抉刃喉蛮绷米傻碉摄禄耽涂狂玩啥豁惫细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,2.平皿克隆分离法,平皿内预置小盖玻片或金属套环再加消化液消化。,3.软琼脂克隆分离法,克隆用毛细管吸出，扩大培养。,次溺滥蒂搬退侵掖竿里奥醇辞蹭柬侧颇尺锦哗笛哎蛆徊疑绊砍洪镜伞既怀细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,参考书籍：1.司徒镇强，吴军正主编。细胞培养，世界图书出版社2.管远志主编。医学微生物学实验技术，化学工业出版社3.辛华主编。现代细胞生物学技术，科学出版社,抡船淮撇争娇博娥桨烹港姓姥仔承爵途格停瘴满渺澡妒卧丑硅损驼涕福瓷细胞培养中的研究方法细胞培养中的研究方法,
