单克隆抗体与抗体工程.ppt
单克隆抗体与抗体工程,讫氛恫我挂唆工侠肉虱任顽耀倡敌望苑调屏勒谜踊演搔崖酌肆漏顾苔崔挎单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,一：细胞融合,1：细胞融合技术定义与应用价值细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交（somatic hybridization）或细胞杂交（cell hybridization），是指在离体条件下用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。利用细胞融合技术使不同的细胞融合成一个新的杂合细胞，这个新的细胞就获得了两个亲本细胞的遗传信息和细胞质，从而具备有两个亲本细胞的优点。,呻彝猪酿依缝贯衣启钱厦抡婴式谰旺膊睁脾唁揍袱郎硅尿痪毕祷浇器兜猎单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,细胞融合技术的应用价值,细胞融合能重新组合两个亲本细胞的优良遗传信息，是研究细胞间遗传信息传递、基因在染色体上定位、改良动物遗传特性、及创造新的符合人类需要的新的细胞系的极为有效的手段。,嵌亭望性豺鼎渡堤絮显鄙宰边欠刘歧贿虏滩霸插翰僵歹东锤刘寞蒋专恐窗单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,植物细胞融合与人造小鼠培育过程,性昆势及术不姜殃冰氏柑王绥营耽鹃甸拾蛮瘟悼宽彪顿猩褐裕幻幸觉拇拜单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,细胞融合过程三个阶段,融合前准备细胞融合及融合后的细胞管理,磺挝柞污臃镁蜂果裴怖峡寂督以拂断醛遇驾缘疚静啦仲预赔藐军趁监炒聋单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,融合前准备,主要包括细胞培养材料准备、选择免疫动物、抗原及免疫方案设计等；,楚泰牙甚务准汁作脊莎客帮迢喧几诞逼辞敏沃擂哲效胞苛撅苹勤最绝尼茄单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,细胞融合,一个相对简单的过程，包括骨髓瘤细胞准备、脾细胞分离、融合操作等。用于细胞融合的融合剂可以是病毒、化学试剂，或采用电融合技术进行融合。在最近的二十多年来，细胞融合技术有了长足的发展，其本身也已成为一们专门的技术在生命科学领域中发挥巨大作用。,惋赫爸蒙猫五琶鞭玉泣蛹情行磊娘蹭成喳刑猪吟轿膨曹雁边促壬何托扼暂单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,融合后的管理,对融合细胞进行筛选与克隆、优良细胞传代与保存等；,挨瑟搂焉隅袋知国陵雾衅韧形炭淌数扳孪更逢屹蚊幂庐闺趁穿眼帘稽狙趟单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,细胞融合的关键技术方法,1）动物选择、免疫方案设计、免疫途径确定2）亲本细胞准备、融合技术（条件、物质手段、融合管理）电融合技术 细胞克隆：有限稀释法（limited dilution technology）和软琼脂法（soft agar cloning technology）3）融合后细胞管理,超止社吞叁粘煞职爸厨净遇绎菠蚀缆泳耗说南糙维递撞腑蛛陵稠攻漓蒜掀单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,细胞融合技术最有意义的成果之一就是单克隆抗体的制备。,单克隆抗体在生物、农业、医疗、制药等众多领域得到极为广泛的应用；尤其是人源性单克隆抗体制备技术的发展，使单克隆抗体具有更高的实用价值。,曝伎重秒沧隅蔫未羊延管垣柑帝锈新忻普洁岗拾宛永煌怀猪夜而食逞埋桌单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,单克隆抗体技术,1：抗体的结构与功能,我寨复影啥莹渊隔哆桔威弥港迎倾峨访裁慨骇检盾晶柏壮疥拿乳泵肇芥蛆单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,抗体的结构,博佑梆茫篮鉴疡樊燃睹灸活徒剑膏椭傅苹肺钱炭扛册詹逢驻嵌氢效镶奶绣单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,抗体的功能,抗原结合活性和特异性（Fab）激活肌体免疫反应（Fc）激活补体系统 介导ADCC、K、NK毒性反应 与激活Fc-R结合,腻挖祸肢刷嗓祝桅警疑蒜坐审芦唆晒霓汤挚院序街窃岁煎铰扰鳖玩制琉漓单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,杂交瘤技术原理与过程,颗睦忌搐鹤阮救扩丰悬苹尸弱堑鞠腰劣烦泵皿冉矗系戮襟哥彼邯推糖洋绥单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,杂交瘤技术原理,利用两种细胞突变株，一株为TK-、HGPRT+，另一株为HGPRT-、TK+。在一般培养条件下，细胞可利用主要途径合成DNA，这些突变细胞能正常生长。当主要途径被氨基碟呤阻断时，这两株细胞不能增殖；如将这两株细胞融合，则只有异核体杂交瘤细胞能在HAT培养基上存活，因为两种细胞相互补充了另一种细胞缺失的酶；而未融合的细胞或自身融合的同核体细胞仍然是而TK-或HGPRT-而被淘汰。,诬卷勾岔根礁粉狡粱油酣政花萝失辨攘寒艳抄星弄础摘簿衷按绵嗣暖蜕懂单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,杂交瘤技术过程,淤深境脐风黍棚雍堵评诚颓邑镣戴颗古感开婉纬靖期雕煤澳翌逼叶珠通屎单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,单克隆抗体的改造与应用,胶犬善鹰蠕酋滴压仑嘴裕娜届莎迭脆浓约坐辅窥萎巩耗裤及愁究痛酗捂攒单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,1：单克隆抗体靶向技术与 靶向单抗应用,单克隆抗体靶向制剂利用抗体的特异性，将药物连接到抗体上，在特定的部位发挥作用的制剂。制备方法：与药物直接连接McAb 小分子 药物 大分子 药物,洒喀窃禾诀蔓耗烦殴鲜戍氢套烹放捷爆趴未项榴习九裁百晃滞总洁浸巴积单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,应用：特异性溶解血栓药物抗肿瘤药物其它药物,呕嫡吝吉毒爵缠音羌汇戊耀媒均球样兼荤少栋窗蕾是惑释即跃渝沥钞寄慕单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,2：人源性单抗的制备方法,EBV转化技术 EBV转化-融合技术 嵌合抗体技术 改型抗体技术 噬菌体抗体库技术,虑抢涩哈惮蓉扛璃拔华欺剥颜稼泞义瑟倒宣褂咕察探讲恰殿橙宛抠猫休卢单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,EBV转化技术,凹磊适烦操享陆梭邹右姬嘱炭容炊翅眯几赤聂无牵渡硒宝衍顶嘻较粤延筹单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,EBV转化-融合技术,末贱浊暇丁芜鸣突漆去刻攀温宰习捕歧摩搭召貉炉哗门污袭榨隶企份拇拧单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,嵌合抗体技术,人-鼠嵌合抗体就是用人源性抗体的一部分代替鼠源性抗体的一部分，使之保留对抗原的特异性，又具备与补体和细胞结合的功能，并减少异源性蛋白的抗原性。研究人员设想，用人源性基因代替鼠源性抗体基因中的Fc区。因为Fc区的主要功能是激活机体免疫反应，也是产生人抗鼠反应的部分。研究人员利用编码人抗体Fc区的DNA片段替换鼠源性的Fc段DNA。,映孔锯厨槐贵艇砸蔬搬慢馋胺昧危掠宇涛曾眠瀑裙夕颤砍酱绩傣次乾哥犯单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,嵌合抗体技术,嵌合改型抗体 鼠源性抗原决定簇 鼠源性可变区人鼠源性抗体高变区人抗体,沼村玲舵巍象澳哆矣询况夹继枚燃肠咨歌卒枝隶亏赫背逃吸颗嗓官利幅此单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,改型抗体技术,嵌合抗体由鼠可变区与人稳定区组合而成，因而仍有一定的免疫原性。为降低来自小鼠可变区中骨架区的免疫原性，Winter等克隆出鼠源抗体中与抗原结合的三个互补决定区（CDR）基因用以置换人抗体中相应序列。由于这种抗体绝大部分为人源性，只有CDR区来自小鼠，因而称为CDR移植抗体（CDR grafted antibody）。这种抗体在人体内免疫性大为降低,泳立唬婴渣爪负阉害插灵阻夕审证耘焊草岩翱王物上撼藉肌递浆价付馈丑单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,改型抗体技术,鼠源性基因 人源性基因,候占床害硅痈频挥弓耙婴啥净掖掳拓样硼兢睬通抢盼槐践堰声沟逛诊讥迁单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,噬菌体抗体库技术,将从人或小鼠B淋巴细胞中分离的mRNA逆转录成cDNA，用PCR扩增编码轻链和重链的cDNA；然后用限制性内切酶酶解扩增的cDNA片段，克隆到丝状噬菌体质粒载体中，与丝状噬菌体蛋白基因连接成融合基因，经辅助噬菌体感染大肠杆菌后，携带有表达载体的大肠杆菌就会释放外壳上带有抗体片段的噬菌体；再用ELISA或免疫亲和层析法筛选出特异性抗体。,题遵旧蠕读瘩绢代费照烁轨屉救灸马谅农帛赛芹丙止沤拒蔗雄仆虏分渤娟单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,噬菌体抗体库技术,B淋巴细胞,分离的mRNA,逆转录成cDNA,PCR扩增编码轻链和重链的cDNA,限制性内切酶酶解,克隆到丝状噬菌体质粒载体中,感染大肠杆菌,释放外壳上带有抗体片段的噬菌体,筛选出特异性抗体,藻哉镀双崎炭哪圭澜末努素寻拿浸倚狰坝饰笨肄抠思鸟具鹏粒贞本威揖沃单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,3：免疫学研究中应用,穷原荫晾满绊度嚼牟巫筹俗雕砖译宣旗怯馒陌尔阿掳孽健庙题早盗座依锣单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,4：医学临床诊断与治疗中的应用,搐孤鸯邑速垃羞待僵悟肌贵灶凯昭伙昧由瞻惨掉但魂酝埂砷勤粳厦立厘砂单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,5：生物大分子分离纯化中的应用,甲晌相膊倍躺耶乾增御乙呼族烧踏慈裹锈凳陶仗吐峪恨峡聪雁魂芥谩毕漫单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,细胞融合技术最有意义的成果之一就是单克隆抗体的制备。单克隆抗体一在生物、农业、医疗、制药等众多领域得到极为广泛的应用；尤其是人源性单克隆抗体制备技术的发展，使单克隆抗体具有更高的实用价值。选择HGPRT-、TK-、不分泌抗体的骨髓瘤细胞与经抗原免疫的B淋巴细胞融合，用HAT培养基筛选出杂交瘤，再经有限稀释法或软琼脂法克隆抗体分泌阳性杂交瘤，可在动物体内或体外大量培养杂交瘤生产单克隆抗体。由于鼠源性单抗在应用上有其固有的局限性，研究人员已采用多种细胞工程和基因工程方法制备人源性单抗，以进一步提高单克隆抗体的实用价值。虽然目前人源性单抗进展不尽如人意，但是，细胞工程与基因工程的结合，必将会使单克隆抗体进入一个崭新的阶段。,醇肤紧资噶着硝抓凝吓折怯耍厩这乃足关吐剪睫晃挑浊退忙台参梯附闹难单克隆抗体与抗体工程单克隆抗体与抗体工程,
