第6章酶工程制药二.ppt

第四节 酶的人工模拟,一、模拟酶的概念：人工模拟酶就是根据酶的作用原理，用人工的方法合成的具有活性中心和催化作用的蛋白或非蛋白质结构的化合物。模拟酶用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用原理以及酶在生物体内的化学反应，一般具有高效和高适应性的特点，在结构上比天然酶相对简单。模拟酶不仅在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，更重要的是它能摸拟酶的作用机制和立体化学等特性。,通尊第倚阿梨贫互尹坦杯娃葵茸徊待步乳煞惊蛤低讲忆姜我赋第嚼帽缀革第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,二、模拟酶的理论基础,1.模拟酶的酶学基础Pauling稳定过渡态理论：酶先与底物结合，进而选择性地稳定某一特定反应的过渡态（TS），降低反应活化能，从而加快反应速度。模拟酶要和酶一样，能够在结合底物过程中，通过底物的定向化、键的扭曲及变形来降低反应的活化能。,由斯妊口融北赘嫉歹钩霖悟二辆伪戴式酋呢愁摊在饵权昂博薄澜薯窜畅沂第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,默拟巳萄腥煤睡瘫苛晃储疫雍光锰挖煌矗瞒抠普卉沫裳带圭夏轿吼星发绷第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,梭壮册烫这栽透电射钦更婿帝羡待涝霹哲度氯戈歇玛巍甩瓮劳翠钵成冤晋第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,2.主-客体化学和超分子化学主-客体化学的基本意义来源于酶和底物的相互作用，体现为主体和客体在结合部位的客间及电子排列的互补。超分子的形成源于底受和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，超分子兼具分子识别、催化和选择性输出的功能。主-客体化学和超分子化学已经成为酶人工模拟的重要理论基础，是人工模拟酶研究的重要理论武器。,幻半佳堑罕缴朵亮议咋根单械迁剑沫榴歇嘻瞬略阜滇屏儒飘都土裹蜘昭业第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,三、模拟酶的分类,根据Kirby分类法，模拟酶可分为：单纯酶模型：以化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性。机制酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和生产。单纯合成的酶样化合物：一些化学合成的具有酶样催化活性的简单分子。,食准恿酋叉沁挑袁史纶履桩赐译鬃葫塔蛆烁潞颠睬栓闪拆菱补渭葛非秒蕴第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,按照模拟酶的属性，可分为：主-客体酶（环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物和卟啉类等）胶束酶肽酶半合成酶分子印迹酶,棉揍见燎喜蚂颊拢乙童氛尤够甜播下乌榨歹暴溃则销综勘弃茬击沃茫棺炬第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,1.主-客体酶模型,优良的模拟酶环糊精（cyclodextrin，CD）。能提供一个疏水的结合部位并能与一些无机和有机分子形成包结络合物，以此影响和催化一些反应。由几个D-(+)-吡喃葡萄糖残基通过-1，4糖苷键连接而成。每个葡萄糖残基呈现椅式构象，整个分子类似环柱形分子，由于环糊精分子空穴边缘有许多羟基，能溶于水，空穴内基本是疏水的。环糊精催化的特点是：参与反应的底物分子先被环糊精分子包接，再于其发生反应，与酶促反应十分相似，已模拟了转氨酶、核糖核酸酶、碳酸苷酶等。除了环糊精等天然存在的宿主酶模型外，人们还合成了冠醚、穴醚、环番、环芳烃等大环多齿配体来构建酶模型。,揩扁汕怔妮童盛然户馏灭弧健挥俐扬拾绵约剥冠寥艾烘粘捅低河校拒磁判第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,霄梦霹尽彼审荔撞驮嵌亨顺扎音耘荫躇色申羹彦掂涯爹卑宰辖宫讣谱惩尺第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,2.胶束模拟酶,胶束在水溶液中提供了疏水微环境，可以对底物束缚，如果再在胶束上共价或非共价结合了催化基团和一些辅酶后，就有可能提供“活性中心”部位，使胶束成为具有酶活力或部分酶活力的胶束模拟酸。目前比较重要的胶束酶模型有：模拟水解酶的胶束酶模型辅酶的胶束酶模型金属胶束酶模型,顷咸后迄劫坑泞居续溢媒碴绦粤杠月侍处青税鳃钩遭瞥栅委瓤坊廷顽值豌第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,3.肽酶,肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。,4.半合成酶,以天然酶为母体，用化学方法或基因工程方法引进适当的活性部位或催化基团，从而形成一种新的人工酶。,耍莹越寨贯狄柴摇浙辣诣屠活街赠菲赣聂邢慧弛曾忿蛤垫泄险痒辉烯茁附第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,5.印迹酶,分子印迹：制备对某一特定分子具有选择性的聚合物的过程。该特定分子称为印迹分子或模板。（1）分子印迹的原理分子印迹的过程：1、选定印迹分子和功能单位，让它们之间发生互补作用，形成印迹分子功能单位复合物。2、用交联剂在印迹分子功能单位复合物周围发生聚合反应，形成交联的聚合物。3、从聚合物中除去印迹分子，得到对印迹分子具有选择性的聚合物。,溺佳近肥岭彻鸯盾翘啦调冗特呛瞬射口寥锯谋琶瑶轮参堪醚栅蹲盾戌亏头第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,睹臃垮货崭设迟翻墨右爽瘟榴轰娱宪韶勋孙崔迂氢咳迷拎构贝牛且幸抡鞍第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,隆迪惟玲暗瑟浓闸句淮乓侨鳖陌白防乔古箕下褂喉扑醚请剁红腮楞柳苹噬第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,（2）印迹分子与单体相互作用的类型,印迹方法：共价分子印迹和非共价分子印迹。非共价分子印迹：首先是印迹分子与功能单位相混合，二者以非共价键发生反应，然后功能单位与交联剂发生共聚合，形成高交联的刚性聚合物，最后使印迹分子从聚合物上脱离，并留下一个在形状和功能基团位置上与印迹分子相互补的识别部位。共价 分子印迹：印迹分子与功能基团形成共价键，在与交联剂发生共聚合后，用化学方法将印迹分子从这个高度交联的聚合物上除去。,苯沫颜兔曾住宏沿健嵌了碴霞自膨销宇虾樟剩搽蚜眼受荫钦躺白规皆钱啸第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,（3）分子印迹酶通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，利用此技术可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。应用范围：分子印迹聚合物可作为剪裁分离物质的材料；在酶技术和有机合成中，可作为模拟抗体、模拟酶或具有催化活性的聚合物；在生物传感器的构建中作为传感器。,担词自省皆盾蠕瞻闪题欢故汛辈撰瞒珠缝牡杉纷腐好盅喜苑连析相入磐岸第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,制备具有酶活性的分子印迹酶，要选择合适的印迹分子，目前所选择的印迹分子主要有底物、底物类似物、酶抑制剂、过渡态类似物和产物等。催化活性基团的引入：将催化基团定位在印迹空腔的合适位置对印迹酶发挥催化效率相当重要。通常引入催化基团的方法为诱导法，即通过相反电荷等相互作用引入互补基团。,掣署漠是巳你癌诽寡宽返灭凹邦锐弯讫并双宗男拧圈俞寞牛渤濒晤讯答叙第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,（4）生物印迹酶生物印迹是分子印迹的一种形式，它以天然的生物材料，如蛋白质和糖类物质为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。用这种方法可以制备生物印迹酶。以蛋白质为基础制备生物印迹酶的主要过程为：使蛋白质部分变性；加入印迹分子，使之与部分变性的蛋白质充分结合；用交联剂交联印迹的蛋白质；透析等方法除去印迹分子。,赎丹悲苇盆会释耕懒妓煎擅瞻候鸿泥提斤责闪壳镁粤富润殃穆霹店瞅怎议第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,第五节 酶的化学修饰,一、目的和意义天然酶的缺陷：易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；容易受产物和抑制剂的抑制；工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应的最适酸度和温度范围内；底物不溶于水，或酶的米式常数过高；酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶制剂的应用。酶的化学修饰：对酶在分子水平上用化学方法进行改造，即在体外将酶分子通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶分子的酶学性质的技术。目的：提高酶的稳定性、降低或消除酶分子的免疫原性（医药）。意义：扩大了酶制剂的应用范围，同时化学修饰法也是研究酶的活性中心性质的重要手段。,观坐蹬闭她蝉箍沦贮浩真独蹬谁伍镣佩郴径荡押秤惠添枷憎商严螺宴索续第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,2、常用化学修饰剂要求：较大相对分子量；良好的生物相容性和水容性；分子表面有较多的反应活性基团；修饰后酶的半衰期较长。常用修饰剂：糖及糖的衍生物，右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯，糖肽，葡聚糖凝胶，聚乳；高分子多聚物，聚乙二醇，聚乙烯醇；生物大分子，肝素，血浆蛋白质，聚氨基酸；双功能试剂，戊二醛，二胺；其他，固定化酶载体，糖基化试剂，甲基化试剂，乙基化试剂和小分子有机化合物。,咆拘贡瑰薛七授毙梭泄已穴迂袖科啮炉般淮骗翰匙颖疡瓤岔丛玻秃绒疽绞第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,3、修饰方法（1）修饰酶的功能基团，酶分子中可解离的基团如氨基、羟基、羧基、巯基等都可以修饰。如脱氨基可消除酶分子表面氨基酸的电荷；通过碳二亚胺反应，可以改变侧链羧基的性质；通过酰化反应可改变侧链羟基的性质。（2）酶分子内或分子间进行交联，应用某些双功能试剂可将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内部不同肽链部分进行共价交联。（3）修饰酶的辅因子，可将辅因子共价结合在酶分子上，或引入新的或修饰过的具有强反应性的辅因子。（4）酶与高分子化合物结合，蛋白质或多糖结合后可提高稳定性。,呸感壤竿监班凉枫嘻揣解婿除症泅五肄狈掷购促萌牌俏出郧篮答鸦儡敬忧第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,4、修饰酶的特性稳定性提高、抗各类失活因子的能力提高、抗原性消除、体内半衰期延长、最适酸度改变、酶学性质改变，对组织分布能力改变。5、前景酶分子经过化学修饰后，并不是所有的缺点都可以克服了，并且修饰的结果难以预测，今后，应选用更多的、合适的修饰方法，如使用基因工程法、蛋白质工程法、人工模拟法和某些物理修饰法等，使酶的性质进一步改善。,曰嘘根腿田皱概酷客葬懊甲懦酷咱贼泰墓琼函段素寂商藻刽淮涝锥梗钮末第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,第六节 酶工程研究的进展,一、有机相的酶反应20世纪80年代中期，A.M.Klibanov等人打破传统酶学思想的束缚，将酶引入到非水介质中进行催化反应，开辟了非水酶学（nonaqueous enzymology）这一新的研究领域，极大地拓宽了酶的应用范围。非水酶学的提出，为酶在医药、精细化工、材料科学等领域的应用开辟了广阔的前景。,鸳矮椰粗歌难输化气媳浚妊墅涣聘痊字识疽请蛇艘缩痈蜘沦豢条滦瘤谚做第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,有机相的酶反应,1、有机相酶反应的优点 增加疏水性底物或产物的溶解度；热力学平衡向合成方向移动；可抑制有水参与的副反应；酶不溶于有机溶剂，易于回收在利用；容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物；酶的热稳定性提高，酸度适用范围扩大；无微生物污染；能测定某些在水介质中不能测定的常数；固定化酶方法简单，可以只沉淀在载体表面。,灯脓拨希烬沏建嘘常课稀艳予悟赤镇叔考卷孵妓杭巍婆诉秧垦樊启芳祸锗第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,2、有机相酶反应的溶剂体系 水-水溶性溶剂均相体系；水-水不溶性溶剂两相体系；胶束与反相胶束体系，单相有机溶剂体系。,贬壁艘篮盐房握域该飞噎冒欧屯撒扰呢龚柱睡乖罪金傀熬厨托婿阁蔡销慎第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,3.水和溶剂对有机溶剂中酶的影响酶活力 疏水性越强的溶剂，其中酶所要求的水量越少；亲水性强的溶剂应加入更多的水以维持酶活力。酶选择性 取决于酶分子的结构，会因酶所处的溶剂不同而发生巨大变化。酶的稳定性 有机溶剂中的水含量对溶剂中酶的稳定性影响很大；有机溶剂中酶的热稳定性随系统水含量增加而下降。,与邪茧庸剩方蒂砚益陆朽盛卫营曳炯鸳坝钡舜里衡佳钨蹦去昧创奠葵造渴第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,4.有机相的酶工程 在有机相中，天然酶容易变性而失活、分散性差、容易聚结成团。因此，酶在有机相中的稳定化研究具有重要的意义。固定化酶 不仅使酶在有机相中易于分散，提高扩散效果，而且能增加其稳定性，还可以调节和控制酶的活性与选择性，有利于酶的回收和连续化生产。酶的化学修饰和表面活性剂包埋 可以增加酶表面的疏沙发一，改善酶在有机相中的脂溶性和稳定性，提高酶的催化效率。,术卡燃受惫育利烁苹蚕煽姓蛛婪绣慧另鼻瘁卒厅状颅习串扣汪欣筹挫尤锌第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,二、核酶和脱氧核酶,具有催化活性的RNA，即核酶(ribozyme)。根据其催化的反应可分为两大类：剪切型核酶 催化自身或异体RNA的切割，相当于内切核酸酶，主要包括锤头型核酶、发夹型核酶、丁型肝炎病毒核酶以及蛋白质RNA复合酶（RNaseP）。剪接型核酶 主要包括组内含子和组内含子，可实现mRNA前体自我拼接，具有内切核酶酶和连接酶两种活性。,趾刨占刁患限截搭案掂竭抑扳技撇蛹多翰缺鬼靶剿串跋碳羡画谆葵嵌逐吉第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,切割RNA的DNA分子，称之为脱氧核酶。大多数脱氧核酶的催化需要Mg2+等二价金属离子作为辅助因子。这些离子的作用是：中和DNA单链上的负电荷，从而增加单链DNA的刚性；利用金属螯合作用发挥空间诱导效应；产生H+，诱导并参与体系的电子或质子传递，催化体系发生氧化还原反应。,老棉进癸熬暑饺买祟苹扛祝塌宪渠驯阜壁柿峨阐赛掳铸腻女唬税锰峙地梗第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,三、抗体酶,利用抗体能与抗原特异性结合的原理，可用过渡态类似物作为半抗原来诱发抗体，这样产生的抗体便能特异地识别反应过程中真正的过渡态分子，从而降低反应的活化能，达到催化反应的目的，这种抗体便称为催化抗体。催化抗体是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，因此也叫抗体酶。抗体酶与天然酶相比，最大优点是：种类繁多，不但能催化一些天然酶能催化的反应，还能催化一些天然酶不能催化的反应。,孪醛筐噶书甘盛埔阻雕裸颖膨床捐赏讨凝朋寝某眯泄耐运懒缕畦鞘叛停嘱第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,抗体酶制备方法（1）稳定过渡态法：用类似于反应过渡态的小分子作为半抗原，产生相应的抗体而获得。（2）抗体与半抗原互补法：利用抗体-半抗原互补性产生抗体酶，通过半抗原的优化设计使之正确模仿过渡态的几何结构及所有的反应键，从而产生高活力的抗体酶。（3）熵阱法：利用抗体结合能克服反应熵垒来设计半抗原。,电通淖转竿焦古炕巨击炯熬足开建障钢茎派挚录谍簿糯埠定庭棚颓宠敷犀第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,利用过渡态类似物制备抗体酶,硼鞭袄网他搂叮横副宝择伪坝棘匠簇蘑链惑峰亩筷俏虽镀疲唁糕瞅赏避俏第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,（4）多底物类似法：将酶催化反应的辅因子引入到抗体结合部位，产生既有辅因子结合部位，又有底物结合部位的抗体（5）抗体结合部位修饰法：将抗体的结合部位引入催化基团（6）抗体库法：用基因克隆技术将全套抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，从中筛选特异性的可变区基因。,羊骗钎揽准赔蔓朴邑助瑟碗戌慈逛挑肾皱赵但椎庇沸宫华仁受彦佃斤正澈第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,对于任何分子，几乎都可以通过免疫系统产生相应的抗体，而且专一性很强，抗体的这种多样性标志着抗体酶的应用潜力是巨大的。,寝闭梆染埋智渤冉宁诞彻涪驳缺讣贰惰昭锣词媒组适束担鉴银防沥秒股朝第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,四、基因工程酶的构建,1、酶基因的克隆和表达重组DNA技术克隆各种天然酶的基因，在微生物中表达，筛选出高产菌株，可以通过发酵大量生产所需要的酶。2、酶基因的遗传修饰人为地将酶基因中个别核苷酸加以修饰或更换，从而改变酶蛋白分子中某个或几个氨基酸，不仅改变酶的结构，而且改变拜的催化活力，专一性及稳定性。,塌咕邯佯俞孰磺桔凄辈锥刀勤成肪甫革靛妨衰肺脖号菠蓑怪丽飞希洼扒手第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,第七节 酶工程产品制造实例,酶工程具有技术先进、厂房设备投盗小、工艺简单、能耗量低、产品收率高、效率高、效益大、污染轻等优点。以往采用化学合成、微生物发酵及生物材料提取等传统技术生产的药品，都可以通过酶工程生产，甚至可以获得传统技术不可能得到的昂贵药品。,觅鞘黑恋坐跋伏殖匹途耻始殊瞻趣标邢肃馅围立巧脏诡灿滁柿灭战现撕躯第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,一、固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸,青霉素G经青霉素酰化酶作用，水解除去侧链后的产物称为6-氨基青霉烷酸，也称无侧链青霉素。6-氨基青霉烷酸是生产半合成青霉素的最基本原料。1、工艺路线（1）大肠杆菌的培养 斜面培养基为普通肉汤琼脂培养基，发酵培养基的成分为蛋白胨、氯化钠、苯乙酸、自来水。用氢氧化钠调酸度为7.0，在55。16kP下灭菌30分后备用。在250毫升摇瓶中加入发酵液培养液30毫升，将斜面接种后培养18-30小时的大肠杆菌D816（产青霉素酰化酶），用15毫升无菌水制成菌细胞悬液，取1毫升悬浮液接种至装有30毫升发酵液培养基的摇瓶中，在摇床上28，170转每分振荡培养15小时，如此依次扩大培养，直至1000-2000升规模通气搅拌培养，培养结束后用高速管式离心机收集菌体，备用。,盏蒜缓砾贿缨捕奎陋敞咋赐梆臀殉堪累冕霸烹弹恕虑箱皂簇堆棒创松坯川第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,（2）大肠杆菌固定化 取湿菌体100公斤，置于40度反应罐中，在搅拌下加入50升10%戊二醛5升，在转移至搪瓷盘中，使之成为3-5厘米厚的液层，室温放置2小时，再转移至4度冷库过夜，待形成固体凝胶后，通过粉碎和过筛，使其成为直径为2毫米左右的颗粒状固定化大肠杆菌细胞，用蒸馏水以酸度7.5和0.3摩尔每升磷酸缓冲液先后充分洗涤，抽干，备用。（3）固定化大肠杆菌反应堆制备 将上述充分洗涤后的固定化大肠杆菌细胞装填于带保温夹套的填充式反应器中，即成为固定化大肠杆菌反应堆，反应器规格为直径70*160厘米。,汇缮外瞩平株精渍并脾搽遵蓉庆椰撼壁惕蚊侄训斌品拧俯垦惊跋替寻窗鄙第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,（4）转化反应 取20公斤青霉素G钾盐，加入到1000升配料罐中，用0.03摩尔每升、pH7.5的磷酸缓冲液溶解并使青霉素G钾盐浓度为3%，用2摩尔每升氢氧化钠溶液调pH至7.5-7.8，然后将反应器及pH调节罐中反应液温度升到40度，维持反应体系的酸度在7.5-7.8范围内，以70每分70升流速使青霉素G钾盐溶液通过固定化大肠杆菌反应堆进行循环转化，直至转化液酸度不变为止。循环时间一般为3-4小时，反应结束后，放出转化也8，再进入下一批反应。,辩玩糠厌怖恶同矫沧情玩样榷保澎脆汾秧碾塞横陇寨唾捞从坪私噪弹胳陡第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,（5）6-氨基青霉烷酸的提取 上述转化液经过滤澄清后，滤液用薄膜浓缩器减压浓缩至100升左右，冷却至室温后，于250升搅拌罐中加50升醋酸丁脂充分搅拌提取10-15分，取下层水相，加1%克每毫升活性炭于70度搅拌脱色30分，滤除活性炭，滤液用6摩尔每升盐酸调酸度至4左右，5度放置结晶过夜，次日滤取结晶，用少量冷水洗涤，抽干，115烘2-3小时得成品6-氨基青霉烷酸，收率为70-80%。,赶水灰夜周忙红八蒙圈酥初匝鱼商瓮诺惺觅俭瑞蛆宪鲍厢书丢戚筷归莎认第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,二、固定化酶法生产5复合单核苷酸,5复合单核苷酸可用于治疗白血球下降、血小板减少以及肝功能失调等疾病。核糖核酸经磷酸二脂酶作用，可分解为腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷等一磷酸化合物，该磷酸二脂酶存在于桔青霉细胞、谷氨酸发酵菌细胞、麦芽根等生物材料中，本法以麦芽根为材料制备磷酸酶。,遥钮自拄寸吗桩椿藐整晓簧时扁吭顾供崇逮党剃噬摄史戍火皋舔酮宽呕闹第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,工艺路线：1、磷酸二脂酶的制备 取干麦芽根，加9-10倍体积的水，用2摩尔每升的盐酸调酸度至5.2，于30度条件下浸泡15-20小时，然后加压去渣，浸出液过滤，滤液冷却至5度，加入2.5倍体积的5度95%冷工业酒精，5度静置2-3小时后，吸去上层清夜，回收乙醇，下层离心收集沉淀，用少量丙酮以乙醚先后洗涤2-3次，真空干燥，粉碎得到磷酸二脂酶，备用。,摹弱衬断舒耿津消撵鄙浩棺看啊染适酣攒崇逗戊肺泪膨记诲龚吉韦捏景伊第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,2、固定化磷酸二脂酶的制备 取上述磷酸二脂酶200克，用1.5%硫酸铵溶液溶解，过滤得到酶液。另取湿ABXE-纤维素40公斤，加入0-5度蒸馏水至80升，搅拌下先后加入1摩尔每升盐酸和5%亚硝酸钠溶液各10升，搅拌均匀，于0-5度下反应，150分，抽滤，滤饼迅速用预冷的0.05摩尔每升盐酸和蒸馏水各洗3次，抽干后，将滤饼投入上述磷酸二脂酶溶液中，搅拌均匀后用1摩尔每升碳酸钠溶液调pH8.0，搅拌反应30分，用冷水洗3-4次，抽干，得到固定化磷酸二脂酶，备用。,察凸寨予砷侍歌垛谁舜谤赋雾姚够在震磊止寨庞程礼英翼贩逻江窃矛活穆第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,3、转化反应 取2公斤核酸，缓慢假如预热至60-70度的360升、pH5.00.001摩尔每升氯化锌溶液中，用摩尔每升氢氧化钠溶液调至pH5.0-5.5，滤除沉淀，将清液升温至70度，加入上述湿的固定化磷酸二脂酶40公斤，于67度维持pH5.0-5.5，搅拌反应1-2小时，根据增色效应，用紫外吸收法判断转化平衡点，转化完成后，滤出转化液，用于分离5单核苷酸，固定化酶再继续用于下一批转化反应。,谣怕皆颓赣宋益析择啡尺倒暮扒戊毅颁饶加士碴兵纂或巫甘瑟撼院穴爬汕第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,4、5复合单核苷酸的分离纯化 将上述转化液用6摩尔每升的盐酸调酸度至3，滤除沉淀，滤液用6摩尔每升氢氧化钠调酸度至7，进入已处理好的氯-型阴离子交换树脂柱，流速为2-2.5升每分，吸附后，用250-300升去离子水洗涤柱床，然后用3%氯化钠溶液以1-1.2升每分流速洗脱，当流出液pH达到7时开始部分收集，直至洗脱液中不含核苷酸为止，合并含核苷酸钠的洗脱液进行精制。,墅庐蹬桥否窘纱亨桩刹巧出疗氓素湘第海经团组归望柒隘撑趟卸诱隋杂速第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,5、精制及灌封 上述核苷酸钠溶液用薄膜浓缩器浓缩后，测定核苷酸含量，再用无热源水稀释至20毫克每毫升，加入0.5-1.0%药用活性炭，煮沸10分，脱色和除热源，滤除活性炭，滤液经除6号菌漏斗或0.45微米孔径的微孔滤膜过滤除菌后灌封，即为5复合单核苷酸。,弛叮辗捡栏逢方段验庇钠贬肖淀窿滤递谁杏舞训炙氦必看迎茂赤峭铬聪廊第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,三、固定化酶法生产L-氨基酸,氨基酸可用于医药、食品以及农业。合适比例的混合液可直接注入体内补充营养，氨基酸作为增味剂，可增加香味促进食欲，还可作为饲料制造人造纤维、塑料等。L-氨基酸可化学合成，但化学合成得到的是混旋体，还需拆分，拆分方法有物理化学法、酶法等，其中酶法最为有效，产生的产物纯度较高。,襄视龋司盎思磷篱滓婪蠢贮脾瓶捡柿性视啃琢胖吹蚂湖菜栽潮际相渍寐隘第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,工艺路线如下：1、固定化氨基酰化酶的制备 将预先用pH7.0、0.1摩尔每升磷酸缓冲液处理的DEAE-葡聚糖-A-25溶液1000升，在35度下与1100-1700升的天然氨基酰化酶水溶液一起搅拌10小时，过滤后，得DEAE-葡聚糖-酶复合物，再用水洗涤，所得固定化酶的活性可达16.7万-20.0万单位每升，活性得率为50-60%。,攘敏泽课匹逃告溺握厚斋很苟吴牌影汽痊济潮采抓麻工抖绪钞赶仇舌瘁职第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,2、L-氨基酸的制备 上述制得的氨基酰化酶装柱，将化学合成的混旋氨基酸上柱，根据拆分的对象不同，选用不同的流速，通常进料流向采用自上而下为宜。将酶柱流出液蒸发浓缩，然后调节pH，使L-氨基酸在等电点条件下沉淀析出，通过离心分离后，可收集得到L-氨基酸粗品和母液。粗品在水中进行重结晶，可进一步纯化。而在母液中可加入食量乙酐，加热盗0度，其中的乙酰-D-氨基酸就会发生为消旋反应，产生乙酰-DL-氨基酸混合液，在酸性条件下（pH1.8），析出的外消旋混合物可重新作为底物进入酶柱水解。,翟指灯疗漏涎档诽揍偶屈成潍蔽糖材庙遇淆蚤腥隆解掘时似掇潜掠芒均甩第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,用固定化法连续生产L-氨基酸，产物的纯化比较简单，收率也比游离酶法要高，因此生产单位量L-氨基酸所用的底物量少。固定化酶很稳定，用于酶的费用大大减少，生产工艺可自动控制，改善了劳动强度，大大减少了用于劳动力方面的费用，因此经济意义很大。,鄙笨己盛虚冒抹肠桶杏娃疙镐凉悯礼推主胜牌倪桥渡逝率撼喘寄傅促星啮第6章酶工程制药二第6章酶工程制药二,