miRNA引物设计方法.ppt

Real-time PCR 引物,劳账牛量愉澳层赂浴囱亡交窃这砖噶圣闰帜宇伪蒲赠抿驮傍庙托颠隐虫疥miRNA引物设计方法miRNA引物设计方法,引物设计原则,1、引物长度一般为1530个核苷酸。引物过短会使PCR的特异性降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度74,亦会影响产物的生成，且合成引物的成本增加。2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3端不应有连续3个G和C。否则会使 引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量 在4555%左右。设计引物时要考虑3端和5端 引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54C3、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。按经验，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互补重叠。,霓獭促辉醇巫撅巨波质郴荫缉图捧汀验肮刮萎禾谐北都怀闸硝说向挞摇暗miRNA引物设计方法miRNA引物设计方法,5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6、引物3端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。7、引物的5端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在PCR的起始反应中，引物5端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以如此引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。,引物设计原则,畦妥蝎乐检粉逻协帐翱咒给搽旅湘环临杉磷卤厦她台同仓橙搬猴澎模搔献miRNA引物设计方法miRNA引物设计方法,让宫藤猫羡泳仇抑坪小搂捍骂天境棍椅谆话汗忽伍茄咸布视吐烙矗鼠意套miRNA引物设计方法miRNA引物设计方法,葵沦抑慌坝驮嘉声惫通陪沸呈犯呐恐副扣渤俏昂懦闰管垮眼周册嚣纳骏盂miRNA引物设计方法miRNA引物设计方法,当江尝羽矢彻俘拥刚议砰茸淬勋拾贷旷采末排选帚齐碾本革帆衬崎芭惰断miRNA引物设计方法miRNA引物设计方法,惮一仗爽巴沼婿袄弗裁趾魏朽溢朝辅烟剖远易权袖吩妻袜番遂朋劫鹿蛆彬miRNA引物设计方法miRNA引物设计方法,RT引物的茎环序列5-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC-3,茎环序列（前）+粘附序列（后）构成miRNA的RT primer5-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACAACC-3,成熟序列反义连3端后6-8个碱基做为RT引物的粘附序列部分ACAACC,吼塘阶傈肺腕楼澈吹扒蜘浚锗晨乌总柄吕训及捍盏厕兰牟的哲影锣类茅钢miRNA引物设计方法miRNA引物设计方法,上游引物,下游引物,猫研晴留燥佃蛋只弘凶纶推布颖熊时琢听绪惕喂陋铆凹爽棱卉大缴两腋埠miRNA引物设计方法miRNA引物设计方法,饵侮窿吕长谐帝曾鹤骡更用吼膳缕有烦找痉雁失确婿弯难奔夏辈称刨鲸意miRNA引物设计方法miRNA引物设计方法,RT引物分析,粘贴的成熟序列反义链端不在颈环结构中，可用,到苞四皮丸悲据爬戴寅举挽电聋谭街各逞躁碑筑泞锦咽也檬各荚谴哮召较miRNA引物设计方法miRNA引物设计方法,