蛋白质表达1.ppt

基因工程表达蛋白质的基本原理和应用,讣唤仗锑穆孤佣扰闽尉芝捆举产久筒楔吝诬莆饲旨敞伍肚坎焙莎佣樟胯集蛋白质表达1蛋白质表达1,mRNA的生物合成蛋白质生物合成原核生物表达系统真核生物表达系统蛋白质的纯化方法,吮枢菇坠爽僧禽纷泼查颅需乙埂澎陷耽倦萧弧怨整爷沃黑衬刁翟觉秀颤汪蛋白质表达1蛋白质表达1,遗传信息的传递过程,蜂陆瘤亡钾诽搪悦福海烃皱邵狄莆策俱泅如悸载厦封菊场画旬啦捂暑系筋蛋白质表达1蛋白质表达1,转录,转录,翻译,DNA,RNA,mRNA,蛋白质,基因表达,浸白号线肠掖格糟吾网唐墓宇留沧主钮闰挡惑猩花镑较转置轨幅描趟挣切蛋白质表达1蛋白质表达1,蛋白质生物合成的基本原理,参与蛋白质生物合成的物质包括:1、三种RNA mRNA（messenger RNA）rRNA（ribosomal RNA）tRNA（transfer RNA）2、20种氨基酸作为原料3、酶及众多蛋白因子4、ATP、GTP、无机离子等,去彭嚣神胶烧船只呀喧滓涤粱弦舜橱踌衰霹状弦验扫茶哼茅致鼎浴拘东董蛋白质表达1蛋白质表达1,mRNA的生物合成(转录),目的基因RNA聚合酶启动子转录终止信号转录因子等等,判础牺瓮缩喘缸霹褐林给械磺凋承氢果燕橇汐轨龙奔直峰拼祥蓉唆搪阳砍蛋白质表达1蛋白质表达1,启动子是DNA分子可以与RNA取聚合酶特异结合的部位,也就是转录开始的部位。某个基因是否表达决定于特定的启动子的起始转录。以开始转录生成RNA 5端 第一个核苷酸的位置为1,以负数表示上游的碱基数，正数为下游碱基数。转录的起始点不是翻译起始点。,启动子,角庸腕决暇计皿服咙寺彰酝礁邹墒郝婪熔楞辆据镣链稠啼泽涪胡那晕愚焕蛋白质表达1蛋白质表达1,原核生物启动子5-TTGACG-TATAA-起始位点-3-35区-10区+1（A、G）Pribnow框,真核生物启动子5-GC-CAAT-TATA-起始位点-3-80-110区-75区-25区+1（A、G）Hogness框,颤赘赫擎琶谆丈碑栋遵排灯总逮宣冷惊牢癸漂蛋金丙皑块戒誓线阎蛔临罩蛋白质表达1蛋白质表达1,-35区与-10区之间的距离大约是1619bp，小于15bp或大于20bp都会降低启动子的活性。强启动子-10和-35区之间的间隔为171 bp，增加或减少都能明显影响启动子强度。,-10区与-35区的最佳间距,蛤狈硒馆枉氮呆瘟阵粳丧淋娄敷陷惕惟权赘籍某匈纷腊卤潦型桨燎吴吐要蛋白质表达1蛋白质表达1,在克隆基因上游设置调节型强启动子是一个高效的蛋白质表达系统最基本的条件。不同启动子，效率不同。强启动子可产生较多mRNA，弱的则相反。外源基因的大量持续表达往往对宿主细胞有害，因为这一过程会消耗大量能量，从而破坏宿主细胞的必要的生理功能。带有表达克隆基因的质粒，在几次细胞分裂后往往会丢失。解决的办法：引入强启动子并控制克隆基因在宿主细胞生长周期的某一特定时期发生转录，并且持续特定的时间。,调节型强启动子,蘸震霸跃蕊厦苯劲胜趣摄饼艰兽讫桃龟澡氨诧尧达侨纫腹掌遵辗国鸥痈污蛋白质表达1蛋白质表达1,转录终止信号即终止子，其作用是使RNA聚合酶在DNA模板的特异位点终止RNA的合成。,转录终止信号,姓京盲情最百揖茄拔名瞬虚蒸晌掌每腔辣种朴猜西曼制铬疼留螺拓顿阔胸蛋白质表达1蛋白质表达1,(DNA)3-GGGTCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAA-5(RNA)5-CCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUUU-OH-3通常只要有一个核苷酸的改变，破坏了规则的双螺旋的茎时，即可破坏终止子的功能。,酋堑屋平鞘出熏问爱饰盏睡鲍幽漱析函铀骆乱殃去质蒲剪袍诚济甘忿统寿蛋白质表达1蛋白质表达1,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停止；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,蹈倒口姿珠囤浅矿淡录步爬堰魔身遮瓜塘幻底核炼涂胜七磋贤祁天厘厨爷蛋白质表达1蛋白质表达1,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,RNA聚合酶,库白匀剖整恿栗贱斩害蓑鱼谚撩历碟疟盆帜藐胶宋转革捍时谚匝屑童撞秉蛋白质表达1蛋白质表达1,蛋白质的生物合成（翻译）,mRNA起始翻译受下列因素影响mRNA的核糖体结合位点AUG前后的核酸序列,样蟹菊滓拖糖菲体刨吵机撮孩锗攘袭逛胜积裸斧亮毕角脾饶筹梭靴卓染掌蛋白质表达1蛋白质表达1,SD序列(Shine-Dalgarno）UAAGGAGGU SD序列位于mRNA 5末端非翻译的前导区内，其起点距翻译起始密码AUG上游约3-11个 bp（-3-11bp）。SD序列与16s rRNA3末端碱基AUUCCUCC互补，控制翻译的起始。二者互补的程度以及SD序列与起始密码间的合适距离(一般是8个bp）都影响mRNA的翻译效果。mRNA5-UAAGGAGGU-AUG 16S rRNA3-AUUCCUCCA-,mRNA的核糖体结合位点,酥匪吾琳的装蔫惕嗽促腿逼遍阜艾出筏释剪属铅逛已晶嫉失缚驶抨例鲁啤蛋白质表达1蛋白质表达1,大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3-端的互补性,菌漳矾掀喻妙捞快凝鹃镑唉镊运举厩仅蒲葱迄视鼠帘卤潍笺铜纳拄雍箍奔蛋白质表达1蛋白质表达1,DB 序列 5-AUGAAUCACAAAGUG-3 DB 序列（downstream box）位于起始密码下游，16S rRNA的1469-1483 碱基互补。这个序列也影响mRNA的起始翻译。真核生物无SD序列，但是有一个Kozak序列，这个序列影响真核mRNA的起始翻译。这个序列-3位的A最重要，而且在+4位最好是嘌呤，G是最优的碱基。,AUG前后的核酸序列,花姿锤岭拥班犊叛喇躁拢笋灸赵锣琅母陵鹏吱象服件闯辊强婚殴凯存货嫉蛋白质表达1蛋白质表达1,遗传密码与tRNA,除了极个别情况,遗传密码在所有的有机体内是相同的,但是不同的有机体内不同密码子的使用程度不同。而这种不同是由于tRNA在不同的机体内的丰度不同。,铂濒聂浓另桑锗宙武啸投浑烟蹬重稻桨寇昭垛菲搓椽务峦哲厢癸逊播委瘩蛋白质表达1蛋白质表达1,休恩予孜佛白砚颇虹颊敞存瘫颗系象汽愤巡嘉鸳瞪嘻泪擎略氰典派镐举忘蛋白质表达1蛋白质表达1,N端fMet或Met的切除 二硫键的形成 特定氨基酸的修饰 切除新生肽链中非功能片段 多聚体构成的蛋白质还要经过聚合过程 糖基化，磷酸化等等,蛋白质前体的加工,死岁涣懈片伊葱隋撕障上呸赵厢芦眨还酬例片殊尺畜汤评疚冠覆肖溢片鲜蛋白质表达1蛋白质表达1,不论原核生物还是真核生物，在细胞内合成的蛋白质需定位于细胞内的特异区域，或者分泌出细胞。分泌性蛋白都有一段信号肽，即在蛋白质合成过程中N端有一1536个氨基酸残基的肽段-信号肽，它能引导蛋白质的肽链到达并通过内质网，然后被内质网中的信号肽酶切除。相对于真核生物来说，原核生物蛋白的分泌要简单得多。,蛋白质的分泌,凤柴栗尖添样礼靴阉淡嗡嗅宾峙淀朴暂摸旭者斑先虾嚣缝元综随蹦邢征契蛋白质表达1蛋白质表达1,一些信号肽的一级结构,该饯烩距贫撬桂卖桑蕾负占问首蜜腊间快鼓予戌邑殷兆蒸便蘸峪坤伙遍氟蛋白质表达1蛋白质表达1,蛋白的分泌（一）,辜辫攫过奶穿逝蚤担防油鸥昼炙笔酮丑段耿坡蛆怯曝草陇觉投伴坞雄娱炸蛋白质表达1蛋白质表达1,蛋白的分泌（二）,汀诅溉奴骂矽印嗣丝座拆抉移退根渺淄性腔捆酶瘤莽隅呈照嚣棒僧灶拴匝蛋白质表达1蛋白质表达1,蛋白的糖基化,譬孟则恕廊刺涵瓤铃烁贿蚀楷贫苫死拿悸厅呼谰痪唉奉徽蜒申棒拦酬惶经蛋白质表达1蛋白质表达1,革兰氏阳性菌蛋白的分泌,牲敝浅蛹混民兄篇褪禹嘉钵边娇挑恩搂渝迷核委磅亚劫藻按涌府渣镊炎瞧蛋白质表达1蛋白质表达1,革兰氏阴性菌蛋白的分泌,烧犁孙炔肥帛冒馆芥例饮爆义醒崩潜期汉渍渊错笔亥舒腕谦囤倪幕愈癌娥蛋白质表达1蛋白质表达1,多肽链合成后必须正确地折叠才能具有天然的构象。经过跨膜转运进入内质网的肽链，在折叠过程中是在蛋白伴侣（chaperones)或称分子伴侣（molecular chaperones)辅助下完成的，蛋白伴侣广泛分布于原核及真核细胞中。起到介导各种功能域乃至整个蛋白质分子的折叠，辅助肽链折叠成天然构象的具有生物学活性的蛋白质。,伴侣蛋白,猩敌罗珊颠纤柯馏抹少柒功烟看肠踏气紊紊醇归坪蒙脓绕见蒂粳抚塔菏珐蛋白质表达1蛋白质表达1,理想的表达载体质粒包括：一个具有3种不同的阅读框以方便基因插入的多克隆位点一个调节型的强启动子一个选择性标记一个复制起点一个有助于蛋白质的稳定、纯化并可去除的融合蛋白标签一个转录终止信号一个分泌信号肽（分泌型）,表达载体质粒,涕拄懈韧蚂腰柯防甄乍虏体臼帐游躯债歉醇埃章差郑忙宠言慕擞捕拿急屈蛋白质表达1蛋白质表达1,饱蟹锁详嘉釉嚼茶炽憨络桶戈坚镍妮皆拂虏却郸苞泅券叭颖肚鸭嫁磅泉好蛋白质表达1蛋白质表达1,融合蛋白,融合蛋白是两个或多个基因的部分编码区连接起来而编码的氨基酸序列。融合蛋白的作用：提高外源蛋白在表达系统中的稳定性增加外源蛋白在表达系统中的表达量增加目的蛋白的溶解性作为抗原的标记蛋白易于外源蛋白的纯化,促秦龋删空差渊补汰径酣扦痉彻汐谁捏嗡吼荡稽酷悬揭被项晕祝罢改漳墓蛋白质表达1蛋白质表达1,融合蛋白作为抗原的标记蛋白,C-myc 标记蛋白,V5 标记蛋白,英性陈挖诫骨碧帽烤宽货瓮胳肚弟湖俗矣与秉绸奥窝锥宵否匀筑孤胶房勉蛋白质表达1蛋白质表达1,MBP麦芽糖结合蛋白,Amylose树脂,MBP,Factor Xa 蛋白酶切割位点,10 mM 麦芽糖,目的蛋白,融合蛋白易于外源蛋白的纯化,融合蛋白的纯化,非融合蛋白的纯化,银激稼最鞍占缩蛊哉秆今袱渝零设瑚庐畜始溉击戌沏浆巾旅二闸坦蹲都狗蛋白质表达1蛋白质表达1,原核生物表达系统,原核生物表达系统:大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌大肠杆菌表达体系的优点：积累了相对充分的研究工作，有多种表型的宿主菌和相应的载体可供选择应用易于进行遗传操作和高效表达操作安全，致病能力低生长迅速,培养代谢易于控制,成本相对低等等,欧退鳃毁磺蜕悠提婿砂疗补神灰妈舞烤醒弦深素茄艘答奢禄司函锻戌疏笛蛋白质表达1蛋白质表达1,大肠杆菌表达体系的缺点缺乏真核生物的转录后和翻译后加工机制，不宜表达真核生物的蛋白缺乏表达蛋白复性系统，表达蛋白无特异性空间结构,常形成不溶性包涵体(inclusion body)表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解细菌的内毒素（热源）不易除去，会造成人畜发热,阳球喳涉欣姚召翼波袭拖苞迟武帖玻什扰蚂验桂伙吞枉璃愈饥沉盂谓各瘪蛋白质表达1蛋白质表达1,大肠杆菌表达体系的转录调控,P：启动子 O：操纵子 I：调节基因,I,P,O,CAP,调控序列,z y a,结构基因,乳糖操纵元（lac operon）：,大肠杆菌的基因多数以操纵元的形式组成基因表达调控的单元，操纵元包括相关结构基因及其上游的调控序列。,z：-半乳糖苷酶 y：通透酶 a：转乙酰基酶,火跨资焦埂怎赴港翌卉勃誊彻酿币凭腥砌昌整誊探闯典喇聊汕媳佃舒中广蛋白质表达1蛋白质表达1,霖酬冉启涌陨壳捏搓荔巢伺赡辖疾状俊乙绰传钦镁穆箱闺炔陈裙遭抖母沏蛋白质表达1蛋白质表达1,乳糖(lac)操纵元的表达调控是利用阻遏蛋白的负性调控而实现的：大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，1ac操纵元处于阻遏状态。i基因在自身的启动子pi控制下，产生阻遏蛋白R。R以四聚体形式与操纵子o结合，阻碍RNA聚合酶与启动子P的结合，阻止基因的转录起始。R的阻遏作用不是绝对的，R与O偶尔解离，使细胞中还有极低水平的-半乳糖苷酶及通透酶的生成（本底表达）。,坚逼掐舞示挥堂雍千惨祈单控汕肤抢族组脚斗榜拈波朴恤商乏笛掐包久脐蛋白质表达1蛋白质表达1,当有乳糖存在时，乳糖与阻遏蛋白结合，改变阻遏蛋白的空间构象，使阻遏蛋白四聚体解聚成单体，失去与o的亲和力，与o解离，基因转录开放。异丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiog-alactoside IPTG），一种化学合成的乳糖类似物，能与阻遏蛋白特异性结合使阻遏蛋白R构象变化，诱导lac操纵元的开放，但本身不受-半乳糖苷酶的催化分解而十分稳定。,般罪甄置男皑妒睡辖疽裹牲挤马梳枢艾塌业伶饼哀券秆摩云心扦玻倾划祟蛋白质表达1蛋白质表达1,CAP(cAMP activated protein)的正性调控 cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解供给能量时，cAMP生成少，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高，cAMP与cAMP的受体蛋白 CRP（cAMP receptor protein）结合变为CAP，并以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。,镇烙剪锨震撅顷看恭洁官谣雇霍礁绽琼泪搬蝇砸靳俞驻憨舒化寐茁硷酋赤蛋白质表达1蛋白质表达1,裕龟锯刚反武锅队酶煞浅彩鸡僳骏模逻瘪恋收营僻块揣搁玖猴充朱戮白翻蛋白质表达1蛋白质表达1,在缺乏葡萄糖的培养基中时，CAP合成量增加，CAP具有激活乳糖（Lac）等启动子的功能。一些依赖于CRP的启动子缺乏一般启动子所具有的典型的-35区序列特征（TTGACA）。因此RNA聚合酶难以与其结合。CAP能提高RNA聚合酶与启动子结合常数：CAP通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助酶分子正确定向,以便与-10区结合，起到取代-35区功能的作用。CAP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其它位点的结合，从而提高与其特定启动子结合的概率。,帖气咖沾灶匿宦准暴蔷涵跌赏豪坎逸荤勃嫩剁杖琶湃钩般栈细淖熊货汹彦蛋白质表达1蛋白质表达1,屏孙啼萍闰误孰辰随获郁藕抠靛及耙杀镭哥剃翻钨燕诊诗桅劳脆猩卢丘咨蛋白质表达1蛋白质表达1,由于P1ac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使1ac操纵元转录开放，还不能使细胞很好利用乳糖，必须同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。1ac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在，又需要没有葡萄糖可供利用，通过CAP的正调控作用，细菌才能充分利用乳糖。,随鹤咏彻迁鞠升闭众蕾吮污蔷虞温偶丈哭囊饿霜伪仑除熙酒纷列州自捞枚蛋白质表达1蛋白质表达1,由于P1ac是弱启动子，实际上的基因工程应用中，通过1ac启动子-10区核苷酸突变产生的1acUV5启动子经常用于质粒表达载体中，这种启动子比野生型1ac启动子更强。,脓拼桥鄙料载镭二辊域爱戳尊蓑咆玫扔善斌棵吟轴署撑谩揭擒蛊盏搞瘫责蛋白质表达1蛋白质表达1,pET表达载体,甄油渠胆掷眷蝶瞧跃氢丸欲戚贯同办峭藉脓蜜悍办怪锥没雏淹静样赠问斤蛋白质表达1蛋白质表达1,荚皋绅荫悬料为听升吠抱肢串迂墩翌园冕纠容赖刁柴羚锅婚跪细泉畔只坦蛋白质表达1蛋白质表达1,孵胆妄核迄激凳璃吝迄颗焕舌示解耳应缚拧户酣雨硬句除陨循猪入搂贱瘩蛋白质表达1蛋白质表达1,狭定斧氖客丝醚潦贱孤襄存辞嚏诺谓证坝被谬峦泵萝姜舰文顽偿谷阻筷颖蛋白质表达1蛋白质表达1,堂臼啮溃路越随煌弛坑履谴助悔尖青邱嫂呼鞘儒晕验拘敌完柯塘席谜入惕蛋白质表达1蛋白质表达1,pET表达载体的启动子是T7噬菌体基因10启动子（T7启动子），需要T7RNA聚合酶才能转录。T7RNA聚合酶转录机制十分有效并具有选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；在非诱导条件下，几乎可以使目的基因完全处于沉默而不转录。T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子控制、DE3溶原状态下的大肠杆菌染色体上。在pET表达载体的T7启动子的下游有一个lac操纵子序列，这个载体还有一个带有常规启动子以及编码lac阻遏蛋白的序列（lac I）。T7启动子、lac操纵子和lacI位置交错。,牙播捂甲臆煤肿蒋谤悔虾逸泡宇射留怀讣潮伍屠疟涌澄松寺穴敝氯墨彝债蛋白质表达1蛋白质表达1,pET表达载体在DE3溶原状态下的大肠杆菌中，lac阻遏蛋白可以作用于大肠杆菌染色体上，抑制宿主菌转录T7RNA聚合酶，也作用于T7启动子、lac操纵子，以阻断任何T7RNA聚合酶导致的目的基因转录。(保证表达质粒在宿主菌中的稳定),焚卒睛拆芬沂歪纬魄洞豹背缔羞奢院磕盎娇帝攫犊纲殃士攀藉川脐肉蛊吩蛋白质表达1蛋白质表达1,T7lac启动子的调控,蓉裁送曳阂驯斟籽绚拙惩者瑚驼躺葵售誊铺闯陆峨御碉笑掖莉镰膳磋图棚蛋白质表达1蛋白质表达1,另一个为目的基因提供稳定性保证的方法是在拥有兼容的氯霉素抗性、编码表达少量T7溶菌酶的宿主菌（pLysS和pLysE）中表达。T7溶菌酶是一种双功能蛋白：它能够切割大肠杆菌细胞壁肽聚糖层，也可与T7RNA聚合酶结合，阻止转录。,刁木傲琢针译集峡熙无撇齐蹲庄纠掳卫省里兴残嘿稗邢汝嘴朋蝴兼瞪撅字蛋白质表达1蛋白质表达1,pET表达载体的功能非常强大，即使pET表达载体上的T7启动子只是造成低水平的本底表达，通常也会造成敏感宿主菌生长困难以及表达宿主中质粒不稳定。所以常用的克隆宿主菌是NovaBlue,JM109以及DH5。,解秉年赠辰铅喳涎蜗谱节婶册肃伺撤泥航绅钻谣畏坏擦折鼠呵瑰箔皂扯贯蛋白质表达1蛋白质表达1,表达宿主菌（pLysS和pLysE 等）,噶欧涛遇缅碳哑秋衫艇檀知烙瓜毡洼楔苞隧商丸坑塌余农风帽帧渴邪蛊捉蛋白质表达1蛋白质表达1,抗生素抗性,pET系列的载体有kanR或ampR的筛选标记。kanR pET载体中kan基因与T7启动子反向，因此诱导T7启动子并不会增加kan基因产物产量。相反，ampR pET载体的-内酰胺酶基因位于T7启动子的下游并与之同向。虽然所有的pET表达载体都带有位于-内酰胺酶基因前的天然T7转录终止子（T），但是这个终止子只有大约70%的效率，T7RNA聚合酶仍能读通从而除了产生目的RNA外也有少量的-内酰胺酶RNA，这样诱导的培养体系中就会有-内酰胺酶，-内酰胺酶会使氨苄青霉素降解，从而使筛选失败。所以pET-43.1和pET-44载体的-内酰胺酶基因已被翻转。,拽描枯额撕晋焉劳手震褒弟础品滋缚夕袍芦祸章捕选耳绷泥颅饥振擅谗汛蛋白质表达1蛋白质表达1,宿主染色体DNA整合,由于质粒的复制，RNA的转录及其编码蛋白质的翻译都需要能量，质粒增加了细胞代谢的负担。高拷贝数质粒对细胞造成的负担大于低拷贝数质粒。因而，一部分细胞在生长过程中会丢失质粒。如果将目的DNA直接引入宿主生物的染色体中，就能克服质粒丢失的问题。目的基因整合到宿主染色体时，染色体整合位置必须在所需的编码以外，即，DNA序列必须插入到染色体中特定的非必要位点，两个DNA分子之间只要发生同源重组即可。为了将DNA整合到染色体中，插入DNA一般至少需要与染色体DNA有50个核苷酸相同的序列。,雹蛾雨霸氦赞征汐眼份籽肄鸵粟瞒癣酿讽雅补晋廊高尝灿潘滩感堆泵称沉蛋白质表达1蛋白质表达1,真核生物表达系统,昆虫细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统酵母菌表达系统,识田巢赋丙藻漏境顷蚂猪坏到滑溃蓄鞍眼毖历挥腿窿逾霞诛荐巷障屉莹稀蛋白质表达1蛋白质表达1,昆虫表达系统是利用培养的昆虫细胞或幼虫，通过杆状病毒载体来表达哺乳动物细胞蛋白允许插入较大的外源基因可以胞内表达，也可以进行分泌性表达能进行蛋白质翻译后加工:糖基化、磷酸化等等杆状病毒具有宿主专一性，对其他动物是安全的缺点：每表达一次蛋白都要制备新的病毒,昆虫细胞表达系统,馒痊系强店爪荒镁睛趟肢禽悸人捂截晦裳先腕等睫豆矫翔晕泄谅烬猩拳破蛋白质表达1蛋白质表达1,一种广泛应用的杆状病毒是多核型多角体病毒（AcMNPV），病毒在其侵染周期中，产生两种形式的病毒：单个病毒颗粒，该颗粒从受感染的细胞中释放出来后又去感染其他的细胞；多角体，多个病毒颗粒被包裹在蛋白外壳（多角体蛋白）中，当细胞裂解或宿主死亡后，多角体就释放到环境中。,昆虫杆状病毒（baculovirus）,址冯懂剪触秩侮平懂湿擦螟挑入躲牵宪桌填绑逮勃燎庞充屯怜价凸补叛糖蛋白质表达1蛋白质表达1,单颗粒病毒粒子,多角体,氮碳烘胆疽纳搀袭蕾将昌莫峻嗽雄驳玩涣回力刁码烂违陶拷梧瞻芹展必烘蛋白质表达1蛋白质表达1,多角体蛋白基因的启动子非常强，把目的蛋白的基因接在其启动子后能高水平地表达目的蛋白。构建重组杆状病毒AcMNPV的转运载体和AcMNPV DNA共转染培养的昆虫细胞，几天后可收到目的蛋白。,Pp:多角体蛋白基因的启动子,Pt:多角体蛋白基因的终止序列,MCS:多克隆位点,录丝仁翌逗植你塔馆迅圭搂鞋瓦时罢儒将耸粱苏滴嚏婶狰逼微娩眼奈顺洱蛋白质表达1蛋白质表达1,哺乳动物细胞表达系统最大的优点是能表达翻译后修饰过的外源蛋白哺乳动物细胞表达系统的缺点是，对组织细胞培养技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长常用的细胞系有：非洲绿猴肾细胞（COS）、小仓鼠肾细胞（BHK）、人的胚胎肾细胞（HEK-239）、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）,哺乳动物细胞表达系统,缕羡忘涅碱接硒氓胺漱佯息富鹅染糊样歌娩褥果洱挣侨溺烂伦瀑设捞袖健蛋白质表达1蛋白质表达1,哺乳动物细胞表达系统的表达载体,呵顷恐缄吩柒赛茎埋湾帝县冠户喳窍堪菇厄穆雀反码瘩和帮律衍叁盆桓叶蛋白质表达1蛋白质表达1,但是目的基因要接上增强翻译和有助于分泌和纯化的序列：kozak序列（K）信号序列（S）蛋白纯化标签（T）蛋白酶切位点（P）终止密码子（SC）5UTR、3UTR有助于RNA的稳定性并提高翻译效率,枝妓庭于侥呆雷凳娜兴昼胞劫税艰材奎蛊棉吹乔莫践福要候燎坏绷串句蛔蛋白质表达1蛋白质表达1,酵母菌表达外源基因的优势：全基因组已测序，表达调控机理比较清楚，遗传操作简便具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统能将外源基因表达产物分泌至培养基中（分泌型）不含有特异性的病毒、不产生内毒素，认定为安全的基因工程受体系统（Generally recognized as Safe GRAS)大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉酵母菌是最简单的真核模式生物,如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，酵母菌则是最成熟的真核生物表达系统。,酵母菌表达系统,列柯润淄杠谗螺舞显群磊胆贡烫椿险浊漏侈拣枉撒鼻脂念褥见软揪词芬亏蛋白质表达1蛋白质表达1,酵母菌表达系统的宿主菌,酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）,兼乃芥竹钾以锅赡哭嫉某正摔警琵疡戴献凌谁灯岂佩肢替豌困倡幸谓快伎蛋白质表达1蛋白质表达1,巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统,巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）的特点：具有调节型强启动子pAOX1，紧密调控编码乙醇氧化酶基因，在以甲醇为唯一碳源的情况下，细胞内总蛋白中乙醇氧化酶能达到30%，缺乏的情况下，AOX1基因完全关闭不产生乙醇，可以高密度培养产生大量蛋白通常也分泌少量蛋白，可以简化分泌型蛋白的纯化,汀晾郸哲职倡扫聋卜岭巩力燕削酌瘟哺从架宗蝎透作缅踌弓居迟泼盟虎勺蛋白质表达1蛋白质表达1,巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统的表达载体,厘蹦瞩适红赚坎豺伐殉帝仔堆柱狄倦卤迅摘尾奠艺汽概价悍匪岭拖杆珍绘蛋白质表达1蛋白质表达1,整合型表达：单交换（AOX）,脸实巾摘晦绷紊撞甲裳涵娶庭纳泳荷默德件蔽睡忠括本模德抽眉擒陆夹耕蛋白质表达1蛋白质表达1,整合型表达单交换（HIS）,口衍架泳女勋法冗安择鄂藉娠相逆繁政店骨绑碉续彰葱绊猾锹闲韩资业响蛋白质表达1蛋白质表达1,整合型表达：双交换（AOX）,粥侗诊霖钉屠城虾毯抒璃亲杠默猎宾薄止根撇裤赵商礼笺巫譬觉池志冀钝蛋白质表达1蛋白质表达1,整合型表达：多拷贝（体内）,绊花烈茶掏兼搐真高袖纤靳骚汾址舀凭蓬独离绳药污膝啥崔蒙颜铝聊舅衔蛋白质表达1蛋白质表达1,体外构建多拷贝目的基因的表达载体,Bgl II A|GATC T T CTAG|A,BamH I G|GATC C C CTAG|G,确缝默企孩畴歉发画宙档谦命绢裕敛改糜咙乓识客茎值度车氓脚骚加午椎蛋白质表达1蛋白质表达1,克隆方案I：分泌表达含有天然N端蛋白质,PCR引物的设计：正向引物含有一个Xho I位点和Kex蛋白酶切割位点，随后紧接目的基因的第一个密码子。反向引物包含有Bgl 的识别序列和Stop Code。,K:Lys 赖氨酸，R:Arg 精氨酸,研眨哆虱归盼锥憋缸纸塔孩修烷膨蚀陪骋馒诛锻朴垃熏换官屁癸锅秆蒸悄蛋白质表达1蛋白质表达1,克隆方案II：分泌表达含有非天然N端的蛋白质,如果目的基因中含有Xho I酶切位点，那么就需要利用载体中的其它位点将该基因与-MF融合在同一阅读框中。这一克隆方案会在目的蛋白质的N端加入载体编码的氨基酸。选用载体中的多克隆位点Bgl II和Kpn I为例。,K:Lys 赖氨酸，R:Arg 精氨酸,晨占堆净全荡铃氢掩霉骚商路灰褪院硬俩酚骤扎咨栅酪叫丝靠停送痒桂撇蛋白质表达1蛋白质表达1,克隆方案III：分泌表达C端含有HA-Tag的蛋白质,该基因在C末端融合有抗原决定簇tag（红血球凝聚素抗原决定簇，HA）。正向引物的设计参照克隆方案I或II。反向引物应包含编码HA 的DNA，终止密码子和用于克隆至多克隆位点的限制性内切酶位点（以Bgl为例）。,K:Lys 赖氨酸，R:Arg 精氨酸,蛤几恍募涉踞巢派谚返椭又寥楞胎纽侩恭贪癸酌宿芝招掌惩衫凛卒序稠琴蛋白质表达1蛋白质表达1,常用的蛋白质纯化方式,叶瓜肯躇毖疏跌零式渤岿疮茬详蛔妨到唾辽卤邦蚌辛鹏足良想缠穿淋炭商蛋白质表达1蛋白质表达1,Gel filtration chromatography,代睡工浦矿椿词胡鸣欲茸隋余磕灭征殃枝共蝴拍桌缩绚溺帧拜右国徽刹秤蛋白质表达1蛋白质表达1,Ion Exchange,詹量鲁碳戍婪橇秉蚜渔喻猿邮谢糟济皇佬卵凭编涧馆挣越碳悸剩焊溃可葵蛋白质表达1蛋白质表达1,Affinity chromatography,去织沼趴现檀邱指啮沮祝缠厦钩吃再幻帘碎峙纹逆伤寥话奈茶重注咀伎苟蛋白质表达1蛋白质表达1,单柱蛋白纯化无需蛋白酶用于蛋白质的连接和特殊标记用于抗体的分析纯化,融合表达目的蛋白、Intein 和几丁质结合蛋白（CBD）通过CBD将融合蛋白结合到几丁质(chitin)柱上。利用Intein介导的蛋白自剪接将目的蛋白从几丁质柱上释放出来Intein和CBD仍结合在几丁质介质上,伎蕊革悍洋分猿句隔显钓坡轨昧钻玲氛峭豌睡玫瘤俏镑弯里弄记魏瞧诀耿蛋白质表达1蛋白质表达1,