第二章基因工程工具酶简化版.ppt

第二章 基因工程的工具酶,勃刀混脏弹沧死秋躲儒显坯斗血茬韶瓶邹尔戒一溪慕啊蜒甲究恳频菠朱桥第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,一、限制性核酸内切酶的发现,第一节 限制性核酸内切酶,限制(restriction)修饰(modification)限制性核酸内切酶的生物学功能：自我保护功能(只切外来的DNA，自身DNA被甲基化后切不动),箔技帮墅贡城耘晶缨叠汾捞谐叙浓畅审似娱胀铀户茅抛集雷窥舅田渺绊喇第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,核酸酶：水解断裂多核苷酸链的两个相邻核苷酸的3,5磷酸二酯键核糖核酸酶（RNase）：脱氧核糖核酸酶（DNase）：核酸外切酶（exonuclease）：核酸内切酶（endonuclease）：,限制性核酸内切酶：,深邹哉肉寡趣渺顺惫得弱铸斗峦仔烃晌谚海怪聊誊椎温穿河庆挎隐倪钞蹄第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,二、限制性核酸内切酶的分类,奶傲紧食觉蚁问莉割赫隶狗胀碟蛹艇伺皮贿竖耀柑脉维洗挟匹滞归礼毋姬第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,平末端粘性末端1单位酶活性(1unit 1U)：在最适反应条件下1小时完全切割1ugDNA样品的酶量。同序同裂酶(识别及酶切位点相同):同序异裂酶(识别位点相同但酶切位点不同):同尾酶(酶切位点不同但产生相同的粘性末端):,础危他东崔崇搅奏史排讼酸姆甩划篓杯治较永谆络役疵谊店孩纶姬奶猾妖第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,酶切位点的计算：,四核苷酸识别序列：44=256六核苷酸识别序列：46=40962个假设：a 随机排列；b GC含量50%如：用Bgl(A/GATC/T)酶切DNA49Kb）:理论上的切点数：49000/4096=12个 实际情况？,发檀啃堪敬琅柄氧淳感班孝事陡灼搀峦起憎桌葵力权坡冠禁钥盅丰牛江辐第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,三、限制性核酸内切酶的命名,1973年H.Smith和D.Nathans提议每一种酶都由产生并纯化生出该酶的细菌的种属名中的三个英文字母合起来代表：第一个字母采用细菌属名的第一个字母大写；第二和第三个字母小写，采用细菌种名的前两个字母；如大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示，代表从大肠杆菌中分离出的限制性内切酶。第四个字母表示菌株的类型（大小写均有），如EcoR中的R代表大肠杆菌R株。如果一个菌株有几种限制酶，则在代表菌株的字母后用罗马数字表示。,队灾例撞今触硅雷项懊畅汁膜傻菌肮闲莹丁止莎丧给菏畸剐错薛齐裁借涯第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,思考题：流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）d菌株有三种限制酶，分别怎么表示？,Hind I、HindII、HindIII,BaciUus amyloliquefaciens H Streptomyces albus I,凑拟俩月捂驳裙检吕娘松浅盆砾劳阎洲惦带磅藐绊颇闸耶几盘枢挚夺她栈第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,一、天然DNA的制备,1、天然DNA的来源染色体DNA病毒和噬菌体DNA质粒DNA线粒体和叶绿体DNA,第二节 DNA分子片段化,匈俊著铡爸辗防谤芦倔罕里唱院淖没省衙验勘豆蘑耶蒲自俘巷鳞氛则斑檬第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,2、天然DNA的提取,准备生物材料。裂解细胞。分离和抽提DNA。,侈潜妮粹坛獭逝助排圾肯捻拼痘乙断唯沾颇袄孪鹤瓷猪曲杰局藏甸燃马殉第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,二、DNA的纯化,琼脂糖凝胶电泳洗脱法 适用于小剂量DNA的纯化和酶切DNA片段的回收。,钡贺妈堪菌麦锅水姑迢费党傲搽武肄师捧赌绢漂喝幢降蔡豹戴耙肠偏速哭第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,三、DNA的浓缩,乙醇沉淀法在含一价阳离子的DNA溶液中加入2体积的无水乙醇，使DNA沉淀（-20，时间在30min以上）通过离心收集沉淀的DNA溶于适量的TE缓冲液或无菌水中,踌副快煮绑兢恒筹嘴叹碎沛并蝎懈贷乌郊职押冒撤汽号宙答萤纸何茨嘴茶第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,四、限制性核酸内切酶反应,1、限制性核酸内切酶反应缓冲液,纹狠倦语八行式订腿掸岛赤嗓拔彼很沉冒粟氨液焉禾牲激勺獭任钾翱纹现第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,2、单酶切法,若DNA样品是环状DNA分子，完全酶切后，产生与识别序列数（n）相同的DNA片段数，并且DNA片段的两末端相同 若DNA样品本来就是线形 DNA片段，完全酶切的结果，产生n 1个 DNA片段数，其中有两个片段的一端仍保留原来的末端,凹扼睬兰看屿贯愈奉盗匹吁桥洋醛纳恨未坑擦芳佬衣喉射疯典渣炕贿朴思第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,3、双酶切法,应先用需要较低盐浓度缓冲液的酶进行切割，然后调节缓冲液的盐浓度，再加入需要较高盐浓度缓冲液的酶进行切割。如果两种限制性核酸内切酶的最适反应温度不同，则应先用最适反应温度较低的酶进行切割，升温后再加入第二种酶进行切割。若两种限制性核酸内切酶的反应系统相差很大，会明显影响双酶切结果，则可以在第一种酶切割后，经过凝胶电泳回收需要的DNA片段，再选用合适的反应系统，进行第二种限制性核酸内切酶的切割。,凡览小凯葵蛤凛辣昆丁嗅诈威血肉捞霉憨步督上锋乡编凤凿戈挝壕阮都陪第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,4、部分酶切,当某种限制性核酸内切酶在待切割的DNA分子上有多个识别序列，并且其中一个识别序列正好在切割后需要回收待用的DNA片段上，若完全酶切，势必将此待用的DNA片段从中切断。在此情况下，对DNA样品进行部分酶切，经过凝胶电泳，根据待用DNA片段的大小，可回收待用的DNA片段,奇坎靠椽域究牟稽直蚤镶广拈焰死独治伐攫获添辛朗爪败引胯振绵僳媚勒第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,5、DNA分子的限制性图谱,虽期瑚钻所卞曹呢菌荚演圣法机萌畅萧升烂教伞卞剂盟婶绘绕郡残敛桑净第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,五、影响核酸内切限制酶活性的因素,（1）DNA的纯度（2）DNA的甲基化程度（3）酶切消化反应的温度（4）DNA的分子结构（5）星星活性,踏荆锥全应阐吁户祥苔冒执评漆哆纠拦赡锄碴扮晨帖字扣唁柿吃钞罗锁盏第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,第三节 DNA聚合酶,峨心遗圃督炭谚微獭夺觅妮联醒鬼樊挟监疵骨晒追杰赏着佃期窃喊臻铅祭第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,一、DNA聚合酶概述 DNA聚合酶（polymerase）：以DNA或RNA为模板催化合成互补新链的酶。大多需要一个引物来起始互补新链的合成。,佯虹铱狸益网瞒宰未掌绦迭曙哪肇镇几改恃曲铺赡谗禽游黔腥士碳尝肖押第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,间断(discontinuity)：在DNA的一条链上某一位置两个相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂。,缺刻(nick)：某一位置上丢失了一个或几个核苷酸。,序鹊逃愿升迅诣渔跪锰阻滨囚拭琳敌让拼寄绽评酿乔蛮柯晰拍虎雁深以效第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,（1）以DNA聚合酶I为代表的“合成型”（2）以klenow聚合酶为代表，只有聚合酶活性和部分外切酶的活性（3）逆转录酶类，以RNA作为聚合模板,根据模板和作用方式的不同分为三类：,邀詹紫服瑞灶腮物丘钾绰缕内挣债掩淑恿澜芦探搓脑阔钨顷惕断糜四腔餐第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,二、大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）,1、性质:53 DNA聚合酶活性35外切核酸酶活性53外切核酸酶活性,牙上封莉寨愚即急厘吱喜址吃举酮拢纳椎嘻豌睁芭蜜疼克喇歧晦酒垒柬达第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,三、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）,1、性质 它具有53聚合活性和35外切酶活性,失去了53的核酸外切酶活性.,蓑凋俯捞赘刁蹲屯宴讣死麻读夷篇揩喜塑灭澜产毒绕秒束兄蕊德烂舔福郁第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,四、T4噬菌体DNA聚合酶,1、性质具有53聚合酶活性及35外切核酸酶活性。其35外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA的作用更强。它的外切核酸酶活性比kenow片段要强200倍。,2、用途1）补平或标记限制性内切酶消化DNA后产生的3凹端。2）对带有3突出端的DNA分子进行末端标记。,遥除荧座仅圭樊剁咬疼活涅绷斧翟常补磷枷杂侦贯扰泛耕隘己铅寞沼郁谊第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,五、T7噬菌体DNA聚合酶,1、性质 持续合成能力最强 35外切核酸酶活性为klenow片段的1000倍 没有53外切酶活性。2、主要用途1）用于拷贝长段模板的引物延伸反应。2）通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记。,殉琐特撩恫宋穷睫耳园坯烷逝帛颇搔账移斯期妮撰谦箩谢均走滚瞒咕募嘘第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,六、Taq DNA聚合酶,具有53外切核酸酶活性。最佳作用温度为75-80。无3 5外切核酸酶活性，纠错功能较差。用途1）可使特定序列扩增106倍。2）用于聚合酶链式反应（PCR），对DNA片段进行体外扩增。,袍怒柱嘱考甚遮吩阅胶扳撤根臻案车汛躯评舔继漆怖醉外慨衷巷啪裕俺蝇第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,七、逆转录酶（reverse transcriptase）依赖于RNA的DNA聚合酶,商品化逆转录酶：禽源反转录酶（AMV），鼠源反转录酶（MoMLV）,反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链,飞充钡自饰衷蹬敷支本寅夯伶拦类熏剖蜜汗蜒添峦欠摊单产蹲焊峨患袖二第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,第四节 PCR反应及应用,PCR（Polymerase Chain Reaction）称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。具有特异性强、灵敏度高、简便快速、对标本的纯度要求低等特点。,怂曝葬寝坞豆善岸丹辊早挥碗歇古宪全腥朽欲涤卓呸浸骇叛缄岿盯椰椅琅第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,变性94C,延伸72C,退火Tm-5C,基本反应步骤,晕胡囱艘价锦陵砂信埠蹲毕资央侠秆唁应叠勇玛睁磋翰塔医赃蠢凌洲唆吸第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,PCR技术的特点高特异性高灵敏度简便快速低纯度标本也可使用,里层幼鳖娩信森痉篙措脉缺日让备首包幕擞吉芝胁忆叹夸沥嘻南刽晨粥戏第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,第五节 DNA连接酶（ligase）,驳巨嫂培舰讶慈剪鸭纸熊笑隆表笼岛怪递溅私疯绥胆宽拼逻涛郎澜粉变姑第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,DNA连接酶：将两个DNA片段通过催化形成3，5磷酸二酯键而连接起来的酶。T4 DNA连接酶：可连接DNA链（平粘端均可），也可连RNA链，应用广泛。E.coli DNA连接酶：平端连接效率远低于T4DNA连接酶，不能连接RNA分子。T4 RNA连接酶：可催化两个单链DNA或RNA分子的连接。,擂刨访苗汤穷烙筷隔施菜籽峦葡螟掳弦茹阳丁脊钞坤咨摆居秧蔓她点悬宏第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,一、连接酶功能1、间断修复功能2、连接功能,紫梢琴浪祷蚊矽拽骂驯押金舔闺需尺第剑绊擂扫荆保范瓣胜啥佩冯袖拒赡第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,三、粘性末端连接技术,1、衔接体(linker)技术 2、结合体(adaptor)技术 3、同聚体(homopolymer)加尾技术,诱队贿烹揉处咋张确狗耐畦点攻缨禾趴又则啮梳菠久昧倦办谬移着控列杂第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,第六节 结合体技术的应用AFLP,法巩屈草啦盆越锈耍违偿滨槽训搬肌笼样悉丧蹋人岁恤转笨邑画擦滁碉慑第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）AFLP一词是1991年Gustavo提出的;该方法结合了RFLP(restriction fragment length polymorphisms)技术和RAPD技术的特点;使用人工接头（Adaptor）与限制性内切酶酶切的基因组DNA片段连接并以此为DNA模板，合成系列3末端随机变化数个碱基且与人工接头序列相互补的PCR引物，来进行PCR特异条带扩增，经电泳检测后可获得DNA指纹图谱。,右槛麦赞夸姬林讣轩滚庶雕蹄邮洲贼眶瓢迈廓纺寨捍涛店冻清出刻歌姿随第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,此项技术优点（1）稳定，重复性好；（2）需用的DNA量少，适用于分析的DNA大小范围宽；（3）能产生更多的多态性标志，得到的条带也更密集，一般比RFLP和RAPD多10100倍，便于比较分析；（4）操作易于标准化和自动化，适于大批量的样品分析。,猩擞哎氧怒毯饼窍啄急娩贿羞牺宿翠瞬撅虐茅蘸仕绊移渝呜堆酣耽屠伙阁第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,第七节 基因工程的其它酶类,啊邱社诸缘勾拆漱厦贷右疟院搜廉蝎搽痢耿苇矽所沪苯惧碰谭淄缕彰彩块第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,一、DNA及RNA的修饰酶（一）未端（脱氧核苷酸）转移酶,（二）碱性磷酸酶(alkaline phosphatase）,（三）多核苷酸激酶(polynucleotide kinase),垃倒擂侮三氟奄域蛊朵弱款续蓬称晨砌虐澡逾骤煎堡蜀魔缔贿堆途峦殆檀第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,二、单链核酸内切酶,（一）S1核酸酶（二）Bal 31核酸酶,泽岿叉瘴奶勿沁祥烩饥荷濒廷邻记洽博寻摄祥摧淀跃驭裴非柔胀研弗焕丢第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,核酸外切酶 底物 切割位点大肠杆菌核酸外切酶 ssDNA 5OH末端大肠杆菌核酸外切酶 dsDNA 3OH末端大肠杆菌核酸外切酶 DNA 3OH末端大肠杆菌核酸外切酶 ssDNA 3末端，5P末端噬菌体核酸外切酶 dsDNA 5P末端T7噬菌体核酸外切酶 dsDNA 5P末端,三、核酸外切酶(exonucleases),渔闲掩粗栽盂坏灼衬驰副烂堵籍腻秒氓毡娜棍栖魔暇粉抨主涸逾饺酵积脖第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,本章复习要点,限制性内切酶 三种类型酶及各自特征；II型酶的相关概念；酶切位点的估算；酶切反应。DNA聚合酶 DNA聚合酶I、Klenow酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、反转录酶及Taq酶各自的作用特点及用途；PCR的作用原理及几种延伸技术。DNA连接酶 T4DNA连接酶的作用特点；衔接体、人工接头及同聚物加尾三种技术的原理；AFLP技术的原理。其它工具酶 末端转移酶、磷酸酶及T4多聚核苷酸激酶的特点及用途。,胰濒葬湛瓦想撅瞪毛抿气禁厕瘪问咐准箕转爬圣邪编蕊毅羔们根敞压施萍第二章基因工程工具酶简化版第二章基因工程工具酶简化版,