DNA提取原理和方法.ppt

,DNA extraction,ZJL2014.05.09,谗断如帕治嫡汞耐效苑浮障燎实哟苍蓟篓巢旺揍郁陈纠豆隐楷桅纵渤晨妈DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白。真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前者为双链线性分子；后者为双链环状分子。除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA；在非细胞型病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样。,DNA extraction,损唁戴段鞍紫砧稗誉售瘁玄蜕锯系轧儒孔忠姬耳蛙爵洪胯呀箍小别粥莆隧DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，钠盐比游离核酸易溶于水。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。,核酸的理化性质,捡槐懊炔捣侮柳舱雀备答啤攀诺而裸文贞啼朝端酗蕴是箔奋淳咨换芍雅暗DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,提取DNA总的原则:,1 保证核酸一级结构的完整性；2 其他生物大分子的污染应降低到最低程度；3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。,哈盏旧寺俗怜职神敦激聚魏耘努栖拟瑚柯芝利蚕绒舆斌脯狞忿邻罐键诱夕DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,DNA提取的几种方法,基因组DNA的提取,非基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,磷郭淌寇禁合搐括崩槽溅挡牌橙匆肄涵孪慈摄叶适夜整狐剁厚滥力澜军捻DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,基因组DNA的提取,根据裂解方式的不同有：,灯上豺郧仗仰玛墨力壤观搬侍磁闷族昌渭缝茶肋清罩适刮扭鼎叛岿奄脱杂DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,吸附材料结合法：,根据核酸分离纯化方式的不同有：,基因组DNA的提取,莽淹按哲榜照被惟嗅耽淫取粮苑炙棒违柜瘫溃碰本谍锚锋惜觉嗽吗辫会试DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,浓盐法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：,利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离,有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用,利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,基因组DNA的提取,窑玄宾寇含蛮约铀戊捕戍鸟锯矿颠婉刮漏肺埠井懈铃杀肿淄仁遇涅攘男呢DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,SDS法流程图（以动物组织为例）,动物组织,细胞裂解,上层溶液,组织匀浆,抽提,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,基因组DNASDS法,迟过器舟搪瞳楞脊芦懂粳壳台拨翱仅田竞丙苛耙滨唇揍童腋忻聋割合吟扰DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,Approximately 1 cm of tail is cut and put into an microfuge tube;Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K,mix well and incubate at 55C overnight or until tissue is dissolved;More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr;Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT;Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT;Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube;Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for 5 min at RT;Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube,add 50 ml 3 M NaOAc(pH=6.0)and 0.5 ml 100%ethanol,invert several times;A NaOAc solution with pH lower than 6.0 will cause the EDTA to precipitate;Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;If there is no pellet,place samples in-80C for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4C;Wash pellet once with 70%ethanol,air dry;Resuspend DNA in ddH2O.Use 100-200 ml ddH2O to get final concentration as 100ng/ml for PCR.,Phenol-chloroform extraction of mouse tail DNA,茬婴渭蝇防煮蔼糠睫陨涤馁藐唇蜕惭苏乾巍傣鼓橡酥钱骇筛擅找辜讫蹲跨DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,1.SDS：十二烷基硫酸钠,2.Tris：缓冲液,3.EDTA,2.Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K,mix well and incubate at 55C overnight or until tissue is dissolved;,作用：细胞裂解时PH值也能稳定,作用：a.溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性,作用：是二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性。,Tail solution:,核匪墓吕拧哥袜增伏边享永骚油连娃驻聘慨绳冉疼侗险哭铣配账起咽魁尤DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,3.More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr;,Proteinase K:,作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。,涸毋催磨渐蚕锤短豢畴皆椿倡试疾融阑沮困洛电严伤娇嗣鼎元充镣叁作桶DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,4.Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT;5.Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT;,优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了DNase的降解作用。缺点：能溶解10-15%的水，从而溶解一部分DNA,Phenol：,Chloroform：,1.加速有机相与液相分层。2.去除DNA水溶液中残留的微量酚。,减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。,Isoamyl alcohol：,浪筹诱贝衣韶粟奢狭淫敝叹奋儿绿桶搬渤鞠连靳吩孪鳖腰篙搓雕烷晒开推DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,7.Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube;8.Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for min at RT;9.Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;,经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。,Chloroform：,任啤派夯早权堪意攘诚邯捕频沦冶投逢整闸磺锁吐顶弥赠圣案笛亮吕粥梨DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,10.Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube,add 50 ml 3M NaOAc(pH=6.0)and 0.5 ml 100%ethanol,invert several times;11.Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;,NaOAc(pH=6.0):,1.沉淀核酸，缩短乙醇沉淀的时间2.提供单价阳离子。减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，,100%ethanol,任意比和水相混溶，夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。但是加其他比例的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。,捌迂刽呜册峡锯残汪索裴根扇咆弃粒宁介扼剑鼎捉马垫机签孜咐幅朱静矮DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,12.If there is no pellet,place samples in-80C for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4C;13.Wash pellet once with 70%ethanol,air dry;14.Resuspend DNA in ddH2O.,DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。2.基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。,DNA的保存：,洪心郊今呸吞条妙混价玖炳息嵌沼数彬册族傀孺帕午然颅耪悠析皖抢双政DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,非基因组DNA的提取,碱裂解法密度梯度离心法煮沸法,质粒DNA的提取,抠躺央夯碗乙岛儡驳栽史轨窃欠忆务纱绎贝奖笺晤坡畏宁唤曲辕觉鸦福溃DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,1、培养细菌使质粒扩增-对数生长后期2、收集和裂解细菌3、质粒DNA的纯化,质粒DNA的提取-碱裂解法,薄喻镭邱渔果们狗侠舔了衡讳庐茎旨诲现灭养咳鲤帖墅守捏荚亲捅赦堤蔑DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,1、培养细菌使质粒扩增-对数生长后期 在含有相应抗性的液体培养基中培养已转化质粒的细菌(单克隆)，使细菌快速增殖的同时质粒DNA得到大量扩增。,质粒DNA的提取-碱裂解法,夕哎昂阴遏赤卞敞犀丹皖人刻蒙骋疥镭柴论漓唤露咕猎氛香哈铭抡视稳休DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,2、收集和裂解细菌 非离子型/离子型去污剂 裂解 有机溶剂/碱 加热,质粒DNA的提取-碱裂解法,减昭毯哎埠签奢福镁牌敬顺藻贩式党庐抢旦卡扑王隧滑染逞烽毛告屈酬块DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,3、质粒DNA的纯化-CsCl-溴化乙锭梯度密度离心 取决于线状DNA与闭环DNA与溴化乙锭结合的量,质粒DNA的提取-碱裂解法,平菏识券塘紊侥辅柄挂哇派唱眶烛瘪蔑戍猖欲蛰尊恭醛局念芳曾晤街彦娥DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,质粒DNA的提取-碱裂解法,梆空茎瓜添叼诚记戳捡漏陈颗泊缩茅赞庸匀踞悦毗关鱼鸟垦氰憎庭饵症蓄DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,离心洗涤,质粒DNA的提取-碱裂解法,渐丈趣泥棕摘篇奠拿祟狞茂望鸟号条沏时适澄俱劈蓄巨月沦近剂崎剔妮镭DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液的成分及作用,溶液 Resuspension Buffer 成分：50mM 葡萄糖/10mM EDTA/25mM Tris-HCl，pH=8.0 葡萄糖:增稠。维持渗透压，防止DNA受机械切力作用降解。EDTA:二价金属离子的螯合剂，抑制DNase的活性。有利于溶菌酶的作用。这一步溶液中还可以加入RNase 溶菌酶：糖苷水解酶。当溶液中PH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。,预篷龙掸怀码裂仅球挣斋曝靠弱褪咒基查恍更钙江囊豫岭厕搜孰满芦椒硷DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,溶液 Lysis Buffer 成分：0.2M NaOH/1%SDS NaOH：溶解细胞，DNA变性 SDS：(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2)解聚细胞中的核蛋白。(3)SDS能与蛋白质结合成为复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。SDS与NaOH联用：增强NaOH的强碱性,SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液的成分及作用,傍念灶略枉涉玻础矩末呢被诀区蔓垢迅掇烹披饶瑚琢老筛枫扮睬拥慢褂酬DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液的成分及作用,溶液 Neutralization Buffer 成分：3M KAc/2M HAc KAc:K+置换了SDS中的Na+，得到PDS沉淀 HAc:中和NaOH,使DNA复性,势皂彝米舱卢将弧莫坏嫌俯风谓皆桐惶贺仑莎呜侍圾搽帐卢跪艾俄泉瘫瓜DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,吸附柱 Spin Column with Collection Tubes,结构：特殊硅基质吸附材料，特异性吸附DNA，而RNA与蛋白质穿过。高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。,信洋毅坯庐敛予泻他旷弛疑卢擂钟临桨婶吵盏釉施理谷卓羚下来牌厘货著DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,大提&小提,区别：1.大提可以用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，而小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。2.一般试剂盒中大提比小提多了溶菌酶、异丙醇（回收沉淀核酸）、LiCl（特异性去除RNA）、含一定量PEG的氯化物（回收质粒DNA）及乙酸铵等，其作用及目的都是有利于细菌的裂解和质粒的纯化，所以大提的产物比小提的量多很多，而且纯度很高。3.小提一般用于质粒鉴定和对纯度要求不是很高的实验，大提用于质粒的大量提取和转染等纯度要求很高的实验。,靶懈挤腾荧谬衷胡濒芹戴夺菩菊辫休屉鹏今土依枚绳营年甥测供浆隧赢偏DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,*内毒素的去除,内毒性也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性胞膜上一种成分，细菌外膜的外部脂质完全由内毒素分子组成。包含疏水区域也包含了亲水和带电区域，从而赋予其与其它分子相互作用的独特性质。细菌在其活跃生长时表面的内毒素成分较少，而一旦其死亡则会释放大量内毒素。在质粒提取的裂解过程中，内毒素会从细菌的外膜释放到裂解液中。内毒素会对原代细胞的DNA转染产生严重影响，同样也会影响培养细胞的敏感性，内毒素水平增加可导致转染效率的大幅下降。,卒鲤央研谰摆厢工烤戊矮摧疮瞻乏恍性峻疥赁迹嫡慨处钦漳江醉砷歪肄悸DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,煮沸法,圭男林嫂牲艘仙绸乐满烤伴缓祭鲍牲蚕澡逼邱尔板循挨亿碎厦瞒湾贡杭惨DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。,差速离心法,戒录趴癣仲先技债汗氯莉枫饼苯度球晕楷虽脑相媳扦仁熄浴衍赐溺涸挥言DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,Thank you!,嚣淑冗矽年芒比拙毙藐浓租荡呀腑续兆查击浸颜狙仓啪肪售奏汇柱惹阉湍DNA提取原理和方法DNA提取原理和方法,