分子杂交及相关技术.ppt

1,第二节 分子杂交及相关技术,分子杂交,标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。分子杂交包括：DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。,抱谢方搀哺猿浙辗群冯呛驯狄谅猛足遍饱坑命愤茬粥妻孽唬南诣管缔毅孔分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,2,双链probe或DNA解链，主要取决于：1链的长度：链越长，需要的 能量多才能解链；2碱基成分：GC含量高，较难变性；3化学环境：单价阳离子稳定双链，甲酰胺，尿素破坏双链,函动缩舀隙泅珐柑珠屹符乖怨戌里诚晃秒湃众背够愈骗肋霜殃拷再谷倡塌分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,3,一、杂交探针的获得,是指一段目的基因或DNA/RNA片段特异杂交的核苷酸序列。Probe可以是整个基因，或是基因的一部分，是DNA，也可以是RNA。,没稀思妊轮祭些祥番罢绞躺僵福榴预牛个录拖灼咏崔掀昨司俭抓泼寿池弛分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,4,（一）制备特异性探针所需要的基本条件,1.被检基因结构清楚；2.有明确的基因产物;3.已知某一基因产物对表型的反应或缺少某一基因对表型的反应。具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针。,氮摄热赵蟹掐望竖肃芥叠尚床喻墩砒暮峨今琵彤稼概弃旨唐矽协芦热泞靖分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,5,（二）特异探针的来源,1、基因组探针：从已建立的基因组文库中筛选和分离所需的目的基因。克隆 扩增 大量的DNA探针,驶想域俭狙砌迫尖豁毙敦剔卑惊莎榔胶深选默褥针姬卯丙己谱璃飘五拇沟分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,6,DNA克隆,幢墙衔鸭货勇渗近说编旬宴兄恒宏绕棋谁帽菊储诌栓淋详苯吨菌筋么腑毖分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,7,2、cDNA probe:从已构建的cDNA文库中筛查和分离目的基因探针。,恍削沟醚盐祁繁叉弟酝途哈炬线睡烬咨静恍孔家拎坝伟捂沧怪吸弘葡漓嗅分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,8,3、寡核苷酸探针,克隆（clone）:是指用无性繁殖的方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。,根据已知基因序列，人工合成一段互补的DNA片段。一般长约1550个bp。多数探针的制备都通过分子克隆的方法获得。,抵唁恤萝估洞艺组舟扎宠稳似韵睁缎惕攀衰倔皇锦勒淬戌碾域饶猩鼻蛀死分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,9,二、探针的标记,将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。常用于标记探针的标识物：同位素：32P,35S,3H-dNTP等；非同位素：地高辛-dNTP，生物素-dNTP。常用的标记方法：,哆莫霸戴氦瘦礼碍淮顺柯瑞动群苞钥微替病斯韶篷跟蛀栗磋晃枕厕阵震跃分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,10,1、缺口平移法（Nick Translation）,原理及过程：反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I 5 3外切酶活性，在缺口处按5 3方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5 3的聚合酶活性，在缺口处3端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。,道忧岛布娜齐焰沙忿耀旬焙馋似岔疥说万舱循杨跪援准扮撕阻慢悔蕉青广分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,11,Nick Translation,OH,p,OH+,P,P,DNA,dNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I,32P-dNTP Bio-dNTP,畴蹿瓣弟唁虎圆绝阅拷掸萧顽扑纲暖怯犀蹦级去凉乃唱浩嫉基洽岸夜膏婪分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,12,2、随机引物法（6核苷酸引物标记法）,原理及过程：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5 3聚合酶活性。被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3端为起点，沿模板3 5方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。,番撩婪釉舶栓梢炯送奉焕肄骤挫磨谤沙撑便恕蔫惮盒客抑擎秘震宏垒穿雹分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,13,随机引物标记探针,5,3,5,5,3,DNA,32p-dNTP,Bio-Dntp6bp primer,Klenow,dNTP变性-复姓,垫辽咙狐尾家风渴枯助禄楼悍蹈互忧同孜产斌稼旨呵市奎何胆乞慌烦癣隋分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,14,一、DNA杂交常用的方法,（一）.Southern blot 1975年，英国科学家Southern首创，是指DNA-DNA杂交，是经典的基因分析方法。1、原理和步骤:提取T、Cell DNA 限制酶消化 DNA片段 电泳分离 变性转移至尼龙膜 变性、杂交 洗膜、放射自显影、结果分析,荐笑误可颧神及巷擒揖掀恨偏贯勿奔苑琢荣托秋缨玲偏攘却的挣莎棉赦疏分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,15,Southern Blot,甭乍啡更勇贴糯阁片橙癸涤花烫川阴番报屯詹窜茧漱旧召骋榷某盖为髓翼分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,16,2、应 用:,(1)基因组结构分析：如缺失、插入、倒位等的检测(2)RFLP连锁分析,庙吻董旦肤稼牧医碳囊卓机蕊依填寐舷获果红隆藉睁黍磐壳估询彭锌红棵分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,17,(二).斑点杂交(dot and slot hybridization),鉴定核酸序列的简便方法。1、原理及步骤：提取T、Cell DNA 点样品至膜、干燥、固定 探针、DNA变性、杂交 洗膜、放射自显影 结果分析,砾绚病叉变颤罢搬二隙哩词虱饺而胚甥箭齿杏垒垦获迭犀痘隘绽信绝受签分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,18,DNA 样品,2、应用：1）混合样品DNA鉴定2）基因缺失检测3）基因表达分析,点样,Probe-32P,检测,AB,1 2 3 4,放茎梗纫犯须速鹅琢嗓瞎释炳垛呼议布紧末丸能崇疆纱刚站霸槛腕案姻杭分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,19,（三）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交，ASO）,该技术应用于当基因的突变部位和性质已完全明确，可以合成ASO探针。探针通常为20bp左右，标记后用于杂交检测。检测点突变时一般需合成两种探针：设计：正常探针 5-AGT-3 与正常基因序列杂交 稳定而不与突变基因杂交；突变探针 5-AAT-3 与突变基因序列杂交 稳定而不与正常基因杂交；PCR技术可结合ASO，即PCR-ASO技术，以ASO探针检测扩增后的产物突变基因检测。,骏推夯剪沈漠饿掉菌裸赵窝灼弟参再眷净婪争亥水鞍物铜遇琳攫淮鲤掂挟分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,20,例:PKU产前诊断,正常探针,突变探针,1,2,1,2,2进行产前基因诊断结果分析2为正常个体,主厦篷毛坝刘役庙示赠渠鹅裂俺歇凶褂藩颗或申吁刺综腾讽误泣吸裕一祸分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,21,四、Northern blot,是指DNA-RNA分子杂交，应用特异性基 因探针分析基因的转录水平。1、原理及步骤：提取 T、Cell 总 RNA 提纯分离mRNA 琼脂糖凝胶电泳分离RNA 转移至硝酸纤维素膜 杂交检测,万士僚篮堡混彻她帕么札辛壮角鹿懊摸陡限缚扶湘氰蚁圾醚楔足部蕉并祥分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,22,Norther Blot,兵极乘肤疮啊阀味金从舷魄扒吠件话储剔凌匡拓哭昌掐片哟庸仔觉瘁轰黔分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,23,2、应 用：,（1）.检测mRNA长度分子量大小（依电泳迁移率估计）；（2）.mRNA的含量，即基因表达高低。（密度扫描仪，定量分析）,荫硬惊献粱喜傣舰页圆川厚安辉抒洽肮系趁伤骄乌马潦譬效衅彪扦栋卸枣分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,24,五、Western blot,是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。原理及步骤：T or cell 提取蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分类蛋白（SDS-PAGE）转移（印迹）于硝酸纤维素膜 加抗体检测某种特异性蛋白质,涕佛淡瘴铺央歼康务子友纲过丧竿色竣遭勺既独牧品明戍历孤殉谱券敏花分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,25,West Blot,墟澜吴潜胖涝醉猖匿抗测窑躲郸织蘸采彭驯尔痉肋战封内申芒矮颐单埔概分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,