1血清谷丙转氨酶活性的测定.ppt
血清谷丙转氨酶活性的测定（King法）,竣埋浮押拼谍鞍半桅费巍篇力笋培层尼尖摘明基安赂匿刹疫班棠侣蜡键万1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,【目的要求】1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。,瞪驴铱疫呛胳酌沙泣噶哑损佐鹤死染腑堡喜医汲崇迈喀檀强闻辩挖仅不址1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,【原理】生物机体内转氨基作用是-氨基酸的氨基通过酶促作用转移到酮酸的酮基位置上，生产相应的酮酸和氨基酸的化学反应。催化这反应的酶称为转氨酶（transaminase），其辅酶为磷酸吡哆醛。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中，在肝、心、肾等组织中的谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase,GPT），谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase,GOT）活性较高。在正常的新陈代谢过程中，血清内维持一定水平的转氨酶活性（即正常值）。当肝、心、肾等组织发生病变时，由于组织细胞肿胀，坏死导致大量的酶释放至血流中，从而引起血清谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性显著升高。因此测定这些酶的活性对某些疾病的临场诊断具有重要的参考价值。,敞凰祈磐交贫怔娶缀土茨赃近邵憎霞被老它筋崖勘馋玲弹撩比翠囤簇扶破1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：,述锐沮滥戴避践卡撇椅图祈臣槐漾工桂秤灰太械革救岭负倔廖拿倦围级女1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。,塔劳疡希面搜蹭锣蚁种锹孺藉沸屋兄栓堵苞致美酷旋卉姜疙蝴瓶窟但驶吼1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,煤愤努剑嘱溺足惹批描萌官垛建宴慎悬穗涕耽星拉悦糖般捕离鸳柏娘细烦1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,King 氏法谷丙转氨酶活性单位：每毫升血清在 37与 pH7.4 的基质液作用 60min，生成 1mol 丙酮酸为一个单位。临床检验取血清量为 0.1mL，报告数据以 100mL 血清计算，因此实际测得结果乘 1000 即可。例如 0.1mL 丙酮酸标准液中丙酮酸含量为 0.2mol，即相当 GPT200U/100mL。,斋妖篇术咆彻嘱章猎哆笼讳蓬致酗顺舱歪稻卜两亨踊疚剃爽促历鞋络到炽1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,试剂与器材,1、样品 动物或人血清2试剂 1)甲液（1/15 mol/L 磷酸氢二钠溶液）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4，A.R.）9.47g 或含十二水磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O，A.R.）23.87g溶于蒸馏水中定容至 1000mL。2)乙液（1/15 mol/L 磷酸二氢钾溶液）称取磷酸二氢钾（KH2PO4，A.R.）9.078g溶于蒸馏水中定容至 1000mL。取甲液 825mL，乙液 175mL 混合，此液 PH应为 7.4。3)GPT 基质液 称取酮戊二酸 29.2mg（2mmol/L）及DL丙氨酸 1.78g（200 mmol/L）溶于 50mL pH7.4 的磷酸缓冲液中，加 0.1 mol/L NaOH溶液约 0.5mL，调节 pH为 7.4，然后加磷酸缓冲液定容至 100mL。加少许氯仿防腐，置冰箱中保存。,蒜趣亦患枫呼菠毁滇耍啊绸噪没渡酒稗实蔑双蕾宗水邀肯刺敢舌如郸贰寸1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,4)2，4二硝基苯肼（1mmol/L）称 2，4二硝基苯肼 20mg。先溶于 10mL 浓盐酸中，使其溶解。再以蒸馏水定容至100mL。5)丙酮酸标准液 精确称取丙酮酸钠 22mg。加磷酸缓冲液溶解后定容至 100mL。此溶液浓度为 2mol/mL，临用前配制。0.4mol/L NaOH 溶液，1/15 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）。3、器材 试管及试管架，移液管（0.5mL，1 mL，5 mL），量筒（10 mL，100 mL），恒温水浴，722 型分光光度计，坐标纸。,今悠喀醇自壬笆疯忠余仅肺饼如疼匀露碱核抢宽螺猿拾泼催此廊逝九亮悄1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,实验内容和步骤,1)制备标准曲线,什株绰眯罩阂劣祁剿妨母饥絮扼吵鹰供揍贵钡亿陀孵赚性病斗仪淫侄粉犁1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,2)绘制标准曲线,以光吸收值为纵坐标，酶活性单位数为横坐标，在坐标纸上绘制各测得A520值与对应的酶活性单位数的标准曲线。,3)样品测定,贺眨察髓贤诈矮遂昨伯饲谩糙维壕怪勾铱棱敬凹六翌馋逾因筏鸟躇质弊梦1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,硕宦起翘利迈拈痒寓灿刁育钢揖皂案俘寅芹屈仲谴吸营处急企褥揪谍坠曝1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,结果计算,标准曲线测定法 根据样品管 A520 值（已减去空白管 A520）查标准曲线，即得每 100mL 血清中转氨酶活性单位数。标准管测定法 每次测定酶活性时，同时用丙酮酸标准液（2mol/mL）0.1mL，平行操作，即按上表操作，不做标准曲线，测定A520按下公式计算：,盏逃贼冀俩怯贿阜髓葛酿司睛羌觅邹薄涸毫返汀吞绩尼初欢层勃排恶唬叙1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,耗异鼓考岂灯滓陡岂怪侣坎獭雇亡飞嚣宋止室贾祭元佑香颖进滨总撤钓妻1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间：King法60min，Mohun法和 Reiman法30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是：每1ml血清在37条件下与底物作用60 min，生成1mol丙酮酸称为一个单位。Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37条件下与底物作用30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单位的定义是：在温度25，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系：1卡门氏单位=0.4821 IU/L(25)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。,贼菲陡脯螟弓疼逊峦嗓墩程峨尧揖喘刚锡雏继浦杀亢钩坏晦胜屏绣耗坎喊1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,改原赖氏法的反应温度(40改为37)和底物浓度(改为低浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较为一致，能较好反映酶的真实活性。由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后，新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。,血园佯滴侗仑增臭培蛙笔卤灼访贴撑纪净鲸绞察眯泣刘擅雁萝蹬涉渡赎蔚1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,注意事项,1)为防止溶血及其他因素对酶活性测定的影响，实验过程所用的一切器皿（注射器、试管等）应清洗干净，干燥后方能使用。2)空腹取血，避免血脂干扰。迅速分出血清，及时测定。3)作为标准物质的丙酮酸钠极易变质。配试剂时应选择外观洁白干燥者。若颜色变黄或潮解，则应重结晶，干燥至衡重后再用。丙酮酸钠重结晶：取纯丙酮 8 份与蒸馏水 2 份混合，加入变质的丙酮酸钠使其达到饱和。此时溶液上层无色，下层有棕黄色油状物。取出上层无色液体置烧杯中，加入两倍体积的丙酮（无水）混匀后，置冰箱中数小时，则有白色丙酮酸钠析出，用布氏漏斗收集沉淀，并用纯丙酮洗涤两次，抽干后，置干燥器内，保存、备用。4)转氨酶只能作用于L氨基酸（L天冬氨酸，L丙氨酸），对 D氨基酸无催化作用。实验室多用DL 氨基酸（因较 L氨基酸价廉），如采用L氨基酸,则需按DL 氨基酸的用量减半。5)为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定 PH，保温时间，选用固定的比色计，比色杯以减少误差。6)血清转氨酶活性高于 500（U）/100mL 血清时，应将血清稀释一定倍数重新测定，其结果应乘以稀释倍数。7)每次测定样品数不要太多，其数量以在显色后 30min 内完成比色为宜。,呆没类掷掐葱炊凹坯纷肩衫寨绑房浙肤救欠呵怔失侵谆框济逊怕函礁施陡1血清谷丙转氨酶活性的测定1血清谷丙转氨酶活性的测定,
