DDRTPCR技术研究进展.ppt
DDRT-PCR技术及应用的研究进展,被筏辽釜溪舀努罗搂尤众澜灼糜们采饲跳隘燃惑这垄慧诚汇揣紊音雹者让DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,前言,基因在不同组织细胞的不同生长阶段的选择性表达决定了生物的整个生命过程个体的生长、发育、细胞周期的调控、衰老及细胞的程序性死亡等。因此分离、鉴定差异表达的基因，研究基因转录对了解生命过程的机理、发现具有特殊功能的表达产物有着重要的意义。,鄙楷酪式磷胆算妖雕痢得架屎搏蹿桔恢胜砂钢妖河锗桶拨萤官惯电颅略凤DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,DDRTPCR,早期，从mRNA转录水平筛选差异表达基因的方法是差别筛选技术和扣除杂交法，但二者存在灵敏度低、工作量大、周期长及步骤繁琐的问题。哈佛大学医学院Liang 和Struss 博士发明了mRNA差异显示技术，即DDRTPCR(differential display of mRNA by PCR)。1994年，Erric Haay等将这种方法正式命名为差异显示反转录聚合酶链式反应(mRNA Differential Display PCR)，简称DDRTPCR,瓜蝎膘钧沈懂撮它捧播透苦浸泽栓椿仙皇榆锤迢撩哩坡蚕戎卯待船膝油褐DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,mRNA差异显示技术的基本原理及实验步骤,1.1 mRNA差异显示技术的基本原理 首先，用3端锚定引物(Anchor Primer)(dT)VN作为反转录引物反转录细胞总mRNA，合成第一链cDNA；然后，在用放射性同位素标记的dNTP存在的情况下，用随机引物(Arbitrary Primer)和与反转录引物相同的锚定引用进行PCR，随机扩增cDNA片段；将PCR产物在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，通过放射自显影展示并回收多态cDNA片段(即EST)；,昔距酶呆响巾校垢琳谐掠限冀界舀痉审扔汪翼夸厢霞法右壤失吹斥颈粤扁DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,将差异带二次PCR扩增并通过Northern杂交来验证、克隆、测序差异cDNA片段。将所得片段用BLAST与GenBank数据库内的已知序列做比较，确定片段是否是新序列(基因)。,联而楞挠恕戌瞳遥倒涌拢侵闻陇裴鹰拴光捶拾皑奢郝曼牙厕裸谷馁叮何剥DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,2 mRNA差异显示技术的优点和缺点 1 优点 周期短，操作简便，省去了cDNA克隆和随后的克隆筛选工作，比递减杂交要迅速；可同时比较2个以上时空特异性及物种特异性表达基因；灵敏度高，所需RNA的量少，该法用PCR扩增，每做100个反应只需1 Ixg mRNA，而递减杂交则需50 Ixg；另外，这种方法的重现性好，在相同条件下重复率可达9095，大大提高了试验结果的可靠性。,磋策爷泽倾寄岿磺酝烦煞屈杨费曹砸齿叛豁瘁帘茶框弊艰搓混掘珐笑酌宣DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,2 缺点,扩增片段短、假阳性高、检测全部mRNA工作量大、基因的克隆受mRNA表达的时效性影响等。而最大的问题还是假阳性太高。据研究，假阳性高达70%所谓假阳性指克隆的DNA片段用Northern杂交时，没有阳性信号,想绘狸传拘翁讽屈腺妇沫购秽酱抓胎京仲平兑伞狸滨嗣蔑好废吝疲铃瘤纯DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,3 DD-PCR中的主要问题及解决办法,内部因素：试剂、酶的质量，引物的类型和纯度，RNA的完整性、浓度和纯度等,外部因素：试验设计、适当的内部控制、回收带的标准、反应体系的建立、PCR管的类型及研究者操作的熟练程度等。,产生假阳性的原因分析,箱穿妖劳拎恃趟古做摊侠因式痹沂虫萤准县难岭招绪知夕臀符盘叶猎镇三DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,3.2改进DD-PCR方法,(1)用无RNA酶的DNA酶处理总RNA，防止DNA污染。(2)使用Tag酶时，批号应相同，不要经常调换。(3)PCR循环次数减至30次，提高退火温度，减少非特异性条带。(4)把从测序胶上切下来的条带纯化后分成两部分，一部分用于克隆，另一部分用作探针杂交以筛选克隆。(5)改变引物长度，如有的在3端锚定引物和5端各加上10个碱基，带上EcoRI双酶切位点，如此可显著提高重复性。,区邵馒瞧脸妄烂卞靳坞藤坯埔抡洱钦耳怎焕神吕炳拐参枫服搭箕夸缠陇禾DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,3.4 克隆差异片段小的解决方法,差异显示得到的片段较小，不能代表真正差异表达的基因。为了得到全长的基因，传统方法是采用cDNA探针从cDNA文库中筛选，比较复杂。目前,人们多采用 Lauren等创造的mRNA 5端逐渐步移技术，以步移法获取的片段大小多在11.5kb之间。另外还有一种叫RACE(cDNA末端快速扩增)的方法，也比较快速，简便。,劝兴炉立祸侥圃塔曼克献铝述闹恒可匙咖挖埃罕顺孽溜报孪熟衰掏险审拓DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,4 引物的改进,起初Liang等设计的引物采用了12种锚定寡聚脱氧嘧啶核苷酸引物oligo(dT)12MN和20种不同的随机引物，缺点：不仅费时费力，由于随机引物长度短导致结果代表性差，而且得到的扩增片段也较小，所以差异条带易呈现假阳性结果。,孽积钝跪至焚痈验锣挪刽匣永净烟颗莲寿人是奄啪颧短伞雏秸杰储筹蝴毙DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,Ito等将原本有两个固定碱基的3端锚定引物变为只有一个固定碱基，使原来l2种引物减至3种(oligo dT 12A，oligo dT 12C，oligo dT 12G)，优点：减少了每个mRNA样品对反转录反应种类的需要，并且把由于简并性引起的某些RNA代表性差和RNA数量过多而引起假阳性的现象降到最低程度。随后又有研究人员对5端引物进行了改进，随机引物条数改为8条，而且在两端引物上都带上了Hind llI酶切位点，使得差异表达片段的克隆变得更加简便,朱堕欠盯碍据咎暑遏深旧搀韦觅撅刁皮卷优优舀粘搞恨焦誓嫉狄渭坝握杀DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,5 mRNA差异显示技术在动物实验中的应用,栾新红等，利用改进后的银染DDPCR法筛选小鼠肝脏中差异表达的基因，并进行鉴定，采用BLAST软件对阳性片段进行同源性分析。结果：经反向Northern blot和测序鉴定后，获得了7条阳性差异表达基因片段(DDESTs)，其中有2条DDESTs只在游泳疲劳组表达，2条呈现下调表达，另3条呈现上调表达,姿晨瘩贞肮只民师雾公惰屏语操苛杉灵峰腮葡襟喀桂濒甥矽加胺藻梁峡肋DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,5 mRNA差异显示技术在动物实验中的应用,孟元光等应用mRNA差异显示技术，筛选子宫内膜癌的相关基因片段。结果 发现自定义的T1.7基因片段在于官内膜癌组织中呈高表达在增生的子宫内膜组织中呈低表达，在正常子宫内膜组织中不表达。因而得出结论T17基因片段可能是子宫内膜癌新的相关基因片段。,舌忆竖令鸿渭啃触习灼轻尊晰恤暮獭娩琳捉灌涅收毋仪膳蜜烬厨帖帚翟件DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,5 mRNA差异显示技术在动物实验中的应用,利用DDRTPCR对不同生理状态或病理过程中基因表达进行分析，能揭示生理活动或病理过程的分子机制：Li等采用DDRTPCR技术，发现梅山猪甲状腺激素亚基过量表达，分析推测认为，亚基的过量表达很可能是梅山猪比白猪合成系早达到性成熟的原因；严云勤等 发现猪肾皮质中表皮生长因子(EGF)mRNA活性很高，而髓质中却无EGFmRNA活性。,茶羞苍蓖战榆叭单撑含惜氏上窑疽劈舌宁哟建舰衰乘曰氧如怀庚淳敝恕城DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,参考文献1 张小芳，金梅。DDRT-PCR技术研究进展J.安徽农学通报,29-30 2 王秀利，李长绿，刘 娣.mRNA差异显示技术的研究J.黑龙江畜牧兽医,2007年第 11期;18-203 吴敏生,王守才,戴景瑞.差异显示技术(DD-PCR)及其应用J植物生理学通讯1999年 第35卷 第4期4 金 谷，罗光彬,陶金程,牛京京.mRNA差异显示技术概述J.饲料博览技术版,2010,第7期,14-17 5 王秀利,李长绿,刘 娣.mRNA差异显示技术的研究J.黑龙江畜牧兽医,2007年,第1 1期 18-206 吴敏生,王守才,戴景瑞.差异显示技术(DD-PCR)及其应用J.植物生理学通讯,1999,第35卷,第4期7 金 谷，罗光彬，陶金程，牛京京.mRNA差异显示技市概述J.饲料博览技术版.2010年,第7期14-178 蒋单懿.mRNA差异显示技术的研究进展J.江苏教育学院学报(自然科学版)2006,9,第23卷,第3期,41-449 栾新红，胡仲明，刘维全，江禹，柳巨雄，王凯.银染DD-PCR法筛选游泳疲劳小 鼠肝脏中差异表达基因的初步研究J.中国应用生理学杂志.296-29810 孟元光,魏丽惠,李春海等.应用mRNA差异显示技术筛选子宫内膜癌相关基因片段J.中华妇产科杂志,2001,6,第36卷,第6期;364-36811严云勤，张黎霞，谭景和.猪肾脏中表皮生长因子mRNA活性的研究J 解剖学 报1999，30(2)：176177,嗡要焦威剐坛匙唉云死谓偶辖则旺卤叭禁菩遁础壹蛹舆旗蔑幽耐灾唬襟汉DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,请各位老师批评指正,西袄原遏北详口啦亲竿躁松醚幼烽览曰化磷锯湾太廊窍羽砖雄谬棺仪怪袒DDRT-PCR技术研究进展DDRT-PCR技术研究进展,
