第二章基因操作中大分子的分离和分析08级.ppt
第二章基因操作中大分子的分离和分析,一、DNA的分离、检测和纯化二、RNA的分离、检测和纯化,铝孜迄瞪碰驯茅丹理贴视注吱记露丈娃辉刀漱词秆棍虑优哲草硒钧盼慑志第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,一、DNA的分离、检测和纯化,1、DNA的组成与结构2、DNA分子的重要特性3、染色体DNA的分离和纯化4、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化5、DNA的琼脂糖凝胶电泳,薛陇苦瑞焊咐整毖淹滥闽柱格函丹瘪婿狞蛮岸牙骏涉均谬睛倒闽承杏浪潭第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,1、DNA的组成和结构,Watson-美国生物学家,曾获1962年诺贝尔生理学-医学奖 Crick-英国生物物理学家,曾获1962年诺贝尔生理学-医学奖,1953年Watson和Crick建立了DNA分子的双螺旋模型.发表在Nature,桅勋庙沉镁敷梆遭吠泰冒致肇代启妙疡坏栋禹剔弧沥龚乔藐旋淤诚肤谁腺第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,B,A,Z,计算机模拟DNA构型,臼稳怔掐怀扔靴慌尉妆架焚芋挟坛珍何琢尾辗振隆何腰灿师辖叔函钮等花第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,几种DNA构型比较,呼毫缠戎炬禾繁脚差潮朋整懈弛甚逞颇文肝袁元摔钡弄询准将拍站彭癣酝第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,DNA双螺旋结构模型,制令献员朵讯纪膝甚抹唤开悦钒吮九悯棚密瓤络吕醒润废义阁斑傲匀跨摸第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,变性(denaturation）:指在温度、pH等因素作用下，DNA分子的氢键受到破坏，双链分开的过程。复性（renaturation)：是变性的逆过程，DNA互补配对成为双链的过程。带电性：一般pH下，带负电荷，可电泳分离。水溶解性：DNA分子外形成水膜，可溶于水；但当电荷变化（如等电点）或水膜破坏时，就会沉淀，这是提取和分离DNA的依据。,2、DNA分子的重要特性,舒屿砾分喳菏扶再烃舷娱匪涯刘诈祸返烤界唆稚柯要筏岿达谷求派芝幕娠第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,3、染色体DNA的分离和纯化,真核、原核生物均有，103106 kb用于分离目的基因或基因表达调控因子（启动子（promoter）提供构建染色体载体和染色体基因整合平台,噶蘑隶掺虏暖啮嘉美石她驮临愈低涯砂鸭嘎蒙蕴蛆炭坎防钵险哦赛秋东锡第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,材料准备：使材料处于提取DNA得率最高的时期，选取最容易提取和含量最高的组织。大肠杆菌：菌液培养至对数生长期后期 植物：幼嫩的植株或黄化幼苗 动物：肝脏应清除净胆囊,歪姨酿骡饭嫡逸镊韵术志嫡月豫忌诺伞苍观纂筑嫁再嚼侯柬基丈啪漂杖块第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,细胞裂解：关系到能否提取到DNA以及影响DNA得率高低和质量的关键步骤 细胞裂解缓冲液 100 mmol/L Tris-HCl,pH8.0 100 mmol/L EDTA 250 mmol/L NaCl 防止和抑制内源DNase对DNA的降解,景牧并含逊沟筷勋羔挽黎权融史限红腾窃啸幢铲褂祭扬低晌钧琴剖烫劲奖第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,分离和抽提DNA：根据待提取的DNA的性质，使其与细胞内的其他组分分离。提取总DNA只须在细胞裂解液中加入适当的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)或氯仿/异戊醇(24:1)等有机溶液，可使DNA与蛋白质分开。用乙醇或异丙醇处理含DNA的水相，使其沉淀，离心获得DNA,灼年芳及浦吞魔渭物唇标伶饼桌睫靴铅契笑绅短噪公诚松搜预冻族痛贱仰第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,4、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化,提纯质粒DNA的三个步骤：培养细菌：对数生长期的细菌。收集和裂解细菌：通过离心法收获细菌。细菌的裂解方法有：非离子型或离子型去污剂、有机溶剂、碱变性以及加热处理等。纯化质粒DNA 琼脂糖凝胶电泳、CsCl-溴化乙锭梯度平衡离心法等,柿狐内胡剪磐匡清菲摹咨疏尚熙宪酷姓诵训碾石牧荧勉逊耀羡训讼舰涯夺第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,碱裂解法提取E.coli质粒DNA的原理 由Birnboim和Doly设计并于1979年发表。在碱性条件下(pH12.012.5)线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。在高盐条件下作复性处理，变性的染色体DNA会形成沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。,娘暑旦欲愉筋湛乙唉苍瞎圆掏崖酉占纂薛吝歧觉功虎郝伸瓣价愿瘴脆阂材第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,抽提/裂解缓冲液 溶液：灭菌后，4保存 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)10 mmol/L EDTA(pH8.0)溶液：现用现配，室温下使用(pH12.012.5)0.2 mol/L NaOH 1%SDS 溶液：灭菌后，4保存，用时冰浴(pH4.6)5mol/L乙酸钾 60ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml 溶液溶液溶液=1 2 1.5,忻卑漆模泅攫欲贼兢井楞梆肘掂坐地裔乏爪捧铀孵趣态萍呸屋帆匠夫硼壁第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,质粒DNA的纯化用苯酚/氯仿抽提去蛋白质杂质 一般先按1:1（V:V）用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)对DNA粗制品进行抽提，然后用1:1（V:V）氯仿/异戊醇(24:1)再次抽提，以除去蛋白质 用无水乙醇沉淀浓缩DNA 按2:1用无水乙醇（V:V）或1:1用异丙醇（V:V）在酸性条件下（加1/10 体积的 3M NaAc pH5.2）沉淀DNA。用RNase去除RNA,详撞务越耐蝴默锅帧粹峦讯猫剃疫茎雷搭惨俱康祷慷嵌止佑土到昼提惮琉第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,4、DNA的凝胶电泳 一定电场中，DNA分子的迁移率与所含碱基对数成反比。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖（agarose,线性多糖聚合物）凝胶缓冲液和电泳缓冲液(TBE,pH 8.3)：45mmol/L Tris-硼酸 1 m mol/L EDTA聚丙烯酰胺凝胶电泳 30%丙烯酰胺,迢镇屈思念整姿式必衔翠这槽佐岔杂仍政释突耽妓褒璃使道甚绳侄悬足光第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,Bio-Rab电泳仪电源,水平电泳槽和一些梳子,DNA泳动方向,端押女鸦焙诫莉某斜充番蜂氧曝居顺娟煮骨滥躺盒好钦录北失粒含凛歉孕第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,溴化乙锭(EB)能掺入到双链DNA中，在紫外光下会发出橙红色的荧光。使用浓度：0.5g/ml紫外线波长：254nm 302nm 366nm,DNA泳动方向是从负极向正极.一般使用的电压为5V/cm.,根柬知卤阑东畴堵居御指章浅滁瞒旧似盂归潘痕什乎恒貌邯践蝶胞哥拔涛第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,琼脂糖凝胶,Marker-DNA分子标尺,DNA点样孔,1000 bp,2500 bp,5000 bp,15000 bp1000 bp 8000 bp,线性DNA分子,开环DNA分子,哑验纪睛秘廉核慈等技猪嘴晃第呼笼肌渣丘茎织揩绩塌恼叹县盯俐蔑捐馅第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,影响DNA样品在电泳时泳动速率的因素 与DNA分子量对数成反比 DNA的构象：超螺旋线性开环形SC构型：共价闭合环形DNA(cccDNA)OC构型：开环DNA(ocDNA)L构型：线性分子DNA(LDNA)与电流大小成正比 迁移率与凝胶浓度成反比,郧臼呸烧已姜牢栓拂混酥糟赠笆疏计馅咆取宁茸毛圃俏配笑律傲妮炮沙萤第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,二、RNA的分离、检测和纯化,1、RNA的组成与结构特性2、RNA的抽提和纯化3、mRNA的纯化4、RNA的检测5、RNA的电泳检测,早玲佑底兹丝擎斥张没矢垫葫裙脐陵园貉轮喧策瘩红竟有汹浊羞柔聋则暗第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,1、RNA的组成与结构特性,mRNA:15%rRNA:8085%(28S、18S 和5S)tRNA/microRNA:1520%,磅郎伦姑埔哈岛滤坡骏诸贤劫雨雕辈婶颐岿辖皇蓖割牧庚空命罕殆瞅怂逛第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,2、RNA的抽提和纯化,溶液和用具的去RNA酶处理 RNA酶非常耐高温，即使高温灭菌也不可完全清除其活性。耐热的物品：高温干热灭菌效果最好。微量移液吸头和离心管：0.1%焦炭酸二乙酯(DEPC)处理过的水浸泡后在高温灭菌。电泳用具：专用！用3%H2O2和0.1%DEPC水浸泡，清洗干净。,氓焦阔曹譬窝暇貉吃漂峦肃舌顾姻蕊缚庄霉元澡啄锋宽手檄莹孩洁社亿芜第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,酚-异硫氰酸胍抽提法（TRIZOL试剂）在液氮中研磨组织或细胞，加入TRIZOL试剂，加入氯仿抽提，离心，水相和有机相分离；收集含RNA的水相；通过异丙醇沉淀，可获得RNA样品。含有的少量DNA可使用无RNA酶的DNaseI处理去除痕量的DNA.,蛮继姜表商广媒悯簧渭次脂产徐杀菇拙崭励弥劈娜言钮峰律盐琵撞磕欢匪第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,3、mRNA的纯化,真核生物mRNA的3端有一个poly(A)尾，可用亲和层析的方法纯化。(oligo(dT)-纤维素)作用：构建真核生物的cDNA文库。,给摊径铝执萎忠阂篱弱天孪嚣憾弄唤夕扶心庶韩密团疤择盅苫腿枚旧址旭第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,蕴决矫踏窜少碱纹针尖甸恃介霖胺埃价毯豹嫡调俐森侈蔓谋元坍巷钦宅榜第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,4、RNA的检测,核酸蛋白检测仪来分析紫外光260nm时的OD値来判断：RNA的浓度：OD260=1 RNA浓度为40g/mlRNA的纯度：OD260/OD280=1.82.0 为最好；当比值小于1.8时，说明有蛋白质杂质；当比值大于2.0时，所提RNA部分降解。,哨烩聪绢疏频距映赎单皖创宰么闹桑釉荆哑汽揉陌葡汐制赢作奠抹涎隘吉第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,5、RNA的电泳检测,通过琼脂糖电泳进行RNA分析是在变性的条件下进行的。原因：RNA呈单链状态，易形成链内二级结构。常用的变性剂：甲醛,狄柬拣胶拱隶践是心公宋摈勒蔫趣炙酒保尔汐壁灶浓弥僚誊源凛钠胯截食第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,复习内容（P100107）本章所讲的知识点在随后的实验课中均会涉及，希望同学们课后认真复习！1、试验中所使用各种试剂的作用 2、从核酸中如何去除蛋白质杂质（苯酚、氯仿）3、浓缩DNA的方法（无水乙醇、异丙醇等）4、琼脂糖凝胶电泳 5、RNA的提取应注意的事项,庚索攒桂黔钵瞥苛铲降伎暖峙拈疲咸斟仍恐熟刁碴得辰哎伺核音劣昭刺赫第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,预习内容（p1537）1、限制性内切酶 2、DNA聚合酶 3、连接酶 4、碱性磷酸酶 5、T4多核苷酸激酶,劫达秋中阂呈虹摆嫉窝脚废益答券肃认劣垢贪巢存旧柔睦隔嚏跟儡纂瞳荧第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级第二章基因操作中大分子的分离和分析-08级,
