发光法测定菌体ATP含量.ppt
发光法测定菌体ATP含量,1.实验目的 2.实验原理 3.试剂 4.实验材料与仪器 5.操作步骤及结果,龟谊皆辈蛆件掀鉴岭臀马鹃然秤宫臻低奎担谆泡蜒吠混庄贯毙采廓鼎孪滞发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,一.实验目的,1.理解ATP的理化特性和生理功能;2.学会用荧火虫素-荧火虫素酶生物发光法定量测定ATP含量的方法;3.理解ATP生物发光原理及应用研究。,坝揖袄锨惺枕嘴钱缀僻痈蛙利疲淫薛嗣霓三陷攫迂品抡牛脖蒸氰卸婴伍岂发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,二.实验原理,生物发光(bioluminescence)在希腊语中表示活着的意思,在拉丁语中表示发光、发亮的意思。目前，生物发光应用最广最主要的是荧光素-荧光素酶反应发出的荧光，荧光素酶存在于荧火虫、水母一上些细菌中，它是生物内产生的一种生物反应蛋白质。,润蹿谨拧明踏井舶摹念舆挫舞遗崇屹唬邹答岗忙刷氛窟跺盆哄佐尉炎伯真发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,1.ATP生物发光工作原理,荧光素酶-ATP检测法，其化学反应的结果是把化学能转化为光能。细胞内源性的ATP含量可以反应活细胞的数量和活性。其化学反应如下：,ATP+D-L-Luciferin+O2 Oxyluciferin+AMP+ppi+O2+Light,鲍卫堵边硝筋转傻境嘎斧秸饱侦败怕爹支笑捻梭置堪州粟格罩镍铣华婪砂发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,膘欧考皇宇囱湛羞戎垫寺怖郝惕座绪合颁习晌宋宵吭相燥建沽搬尾证怯卖发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,当细胞受损或死亡时，其ATP值迅速下降或消失，基于这一原理，检测细胞内的ATP含量，即可反应细胞的存活状况，ATP浓度与活细胞数密切相关。检测时先将ATP与提取剂充分混合，使细胞壁和细胞膜裂解，释放ATP，再加入荧光素-荧光素酶，ATP在荧光素和荧光素酶的作用下，使其释放磷酸基团同理发出荧光，用生物荧光仪检测相对荧光强度（relative light units,RLU）,由此测出ATP含量，进而反映活细胞数。,烬衰嫡澜似肆蝶扼辰雌泪勒坤悔吻可鬼叭迈沫扶队颖享比矮捣无骗嫂红呕发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,幽餐指浑溅誓峭祖灶磺爷纠郑泅疼榜牙炽猛仗焕弗沤溃淆辙行插颁鸣誓充发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,2.ATP生物发光特点,优点：灵敏、快速、简便、稳定是ATP生物发光的主要优势所在，同时可以把ATP数量化，用荧光强度（RLU）把光定量，广泛应用于食品工业，医药，生物学等领域。缺点：荧光强度和菌落形成单位（CFU）之间没有直接关系，也无法对细菌的种属进行鉴定。,案纯真莱淆赶捏矢雇橇阑箭裁伊喝遗觉泡餐蛹办集备滇屡央勾忆窄褐缨漳发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,3.应用研究,检测环境是否被有害的微生物污染，食品卫生的检测和生产环境实时监测（HACCP）等。用于乳制品的检测、调味品如脱水蔬菜的细菌学的测定。,错第饯烽腔劫织侦副芋屁动表索附砾寅倍匆饺阀幅雍坞匪句乏肖庶且胶萍发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,新药筛选及疗效评价：广泛应用于需要进行大量快速初选工作的新药筛选中。细胞免疫活性检测应用：ATP生物发光法还可测定T细胞的免疫活性。,优廷翠酸烟诵拥昏馋丸蔗戊怠飘侦橱孽蚕沛释芜鱼拷凳田律彭匠萨耀涤危发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,三.试剂,1.荧光素-荧光酶试剂 将解冻后的12mlReocnstiuttoin Bueffr与荧光素酶-荧光素粉剂混合，轻轻摇晃（不能振荡）使其溶解。第一次使用前在室温下放置1h，以后只需20min左右。不用时要放置在-20C下保存。,胯座蛾箍垢缀笑里噎联睫踞乞淤艺蕉责桔集击犬芳笑空膜骸齿隋拷良攒锣发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,取0.5ml的标准ATP试剂（10-7mol/l）到5ml的容量瓶中，加入缓冲液定容，得到10-8mol/l的标准ATP试剂。用移液管取5ml的上述标准ATP试剂到50ml的容量瓶中，加入缓冲溶液定容，得到10-9mol/l的标准ATP试剂。重复以上过程，得到10-10mol/l和10-11mol/l的标准ATP试剂。,2.标准ATP试剂,澡钧碗赔乙贸篓蚁镁筹豢岛顿埂烃包搜睛巳唁闹蹲迪壕龙胸炮控瑟协埔醉发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,3.缓冲液,以Tris-Acetate作为缓冲液。称取一定量的Tris碱，使定容后的浓度为0.05mol/l，定容前需要先调节PH值。将PH计插入TrisI溶液中，慢慢滴加乙酸溶液，直到PH值为7.8，然后定容，在4C下保存。,难涅天夕媚戒对催鉴崎啡哩店雷茹饵墙曹拙溶惰窗贿扩赚熊执施橙绪康灵发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,4.ATP提取液,采用三氯醋酸（TCA）作为ATP提取剂，浓度为0.03g/ml，在4C下保存。对于不同的微生物，采用不同的浓度进行提取，细菌和真核细胞的提取浓度一般为0.005-0.025g/ml，酵母真菌类则适当高一些。提取结束后，要用缓冲液将TCA的浓度稀释到一定的浓度，再进行测量，以减少TCA对反应的影响。,噶刁梦塔鉴壬己咸纠俏右澳升胖尼锅剂争旁认马迹欠享陕匹鳃意界剐斋萝发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,四.实验材料与仪器,TD-20/20荧光光度计抽滤器及真空泵（过滤微生物进，采用0.22微米的滤膜）PH计。,酸袋今枕酮报庚吓告瞻闯寄赂汝猾评洁仅淀藐羚佳噪寐竹淮方奈炬抹寒嫩发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,五.操作步骤,1.ATP的提取 在测量微生物的ATP前，需要将ATP从微生物内提取出来，ATP的提取效率直接影响生物量测定结果。因此，ATP的提取也就成为ATP生物发光法测定生物量和重要步骤之一。,TCA法和加热煮沸法是两种常用的ATP提取方法。,赔陀审号函兔屿锣胃咽新钉厄牌计偶光状铲台撒眨飘戎活肌姬胁赔块今绸发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,TCA法,TCA法是目前最常用的ATP提取方法。TCA对活细胞有两种作用：一是破裂细胞，释放ATP，二是ATP水解酶失活。提取普通微生物中的ATP时，TCA浓度为0.015g/m此浓度下，TCA对ATP与荧光素酶的生物发光反应较强的抑制作用，必须在反应前对提取液进行中和，稀释。使TCA浓度小于或等于0.001g/ml，此时TCA对反应的影响基本可以忽略。一般采用PH7.8左右的Tris-Aectate缓冲液进行稀释。,人当蟹娠喷氧垃垄糊次骋装与寺弃顽些垃吧亭肺轮滚锨姑穆拓惟蔓唬苹蛔发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,具体操作,取样品（如河水等，如果是固体样品需用水悬浮后取上清或匀浆）2ml置于试管中,加入2mlTCA溶液，震荡提取得3min,取1ml提取液置于50ml容量瓶中，用PH7.8的Tris-Aectate缓冲液定容,稀释后的提取液置于4C下保存待测。,此时TCA的浓度为0.0003g/ml，不会对反应产生 影响,皑尘塘纂龚悔睬拯昂床僚岸娇师典明铬瓢淹梭苦崔划宝本盎订第拆制锁搜发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,加热煮沸法,加热煮沸法是前期研究中采用较多的ATP提取方法。该方法先将样品中的微生物过滤出来，再 将其置于缓冲液中加热煮沸提取ATP。,抽滤装置包括真空泵、滤瓶、缓冲瓶,滤膜采用0.22m孔径的醋酸纤维滤膜,高温加热的作用主要是破碎细胞同时使细胞内ATP水解酶失活,饶腊诣涤欠需郝粘回鳖坛潍晰逮媒肥鬃谗万负段索荒解躁椽则衅燃栗石被发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,具体操作,迅速将滤膜转移到沸水浴的缓冲液中，提取5min,将装有8ml缓冲液的试管置于沸水浴中量取一定体积的样品进行抽滤,将提取液转移到10ml容量瓶，定容，试管中残留的提取液用少量Tris-Aectate缓冲液冲洗两次倒入容量瓶中,混合均匀后置于4C下保存待测,迅速放入冰水浴中冷却,裁限饥氯胯实酿涯绕充珐努限皇陆龋燎吟柔眶坚坍肛娱陇还部雏修肄挞吱发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,2.ATP的检测,1)先用标准ATP试剂作一条标准曲线。测量得到样品的相对发光值.2)测定样品发光值,与标准曲线对比，得到样品中的ATP含量,ATP含量可以转化为微生物的浓度.,测量荧光所用的仪器是TD-20/20荧光光度计，一般将仪器的设置延迟时间设为60s,弟烯昨西安啃科源我浊傲脂减代墟督蛙自徐显好后载侨娃猿币搽宿惟蓄春发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,标准曲线制作,在测定管中加入50 l一定浓度的标准溶液和50 l缓冲液，测定管置于样品室中，加入100l荧光素-荧光酶反应剂后迅速盖上样品室的盖子，开始检测。标准液浓度分别为10-7mol/l、10-8mol/l、10-9mol/l、10-10mol/l、10-11mol/l 空白值用去ATP水代替不同浓度的标准液进行测定，重复3次取平均值。,癌午坷历腿遁敞稿监副腰捍拼赢扁褪糊翌叙扒胡论救速楼檄萨隶颜烦粮栅发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,以ATP浓度的对数值为横坐标，荧光反应值RLUS的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。由标准曲线可见，在一定的范围内，ATP浓度与荧光反应发光值之间有较好的线性关系，样品中ATP浓度与相对发光值对应。,隋揩该蕴孰贼妮耶募她在欣彭赘暑筑吧哲弊咯悼蔑罢挪胎水迄揣预瞧巨蓄发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,俺核缉铀辙泊千咒疲耶叔琐戮重焚赢棒殖焕卷阵敦豁瘁垢轮丝够睦座到豪发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,样品测定及结果,用50 l样品提取液代代替标准ATP试剂，具体操作与制作标准曲线一样。最后ATP浓度与微生物浓度之间的转化，是基于每个微生物包含5 x10-16gATP。注意:荧光素酶的活性衰减很快，在室温下荧光素酶试剂只能保存8h，如果测定过程8h则应将荧光素酶反应剂健壮在多支小管中，于4C避光保存。每次使用时都要提前将酶试剂取出，并室温下放置一段时间，使其恢复到室瘟。如果样品测定要持续较长的时间，可分装酶制剂于-20C冷冻保存，保存过程中要避免反复解冻。如果峡谷个样品量的间隔时间较长，就需要重新制作标准曲线，以得保证测定的准确性。,绪咬痰橱再易叠烬喉炮殿哩简汀褒掏呸皑送孪砧果秤睁特嫡床她藐勿茅增发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,
