选修三11《DNA重组技术的基本工具》.ppt

专题一基因工程,白银五中 李红霞,设想一,能否培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？,胰岛素是治疗糖尿病的特效药,长期以来只能从猪、牛等动物的胰腺中提取，产量低成本高。而微生物生长迅速，容易控制。于是科学家设想，若能将人的胰岛素基因导入微生物体内，并得以表达，就不仅能解决产量问题，还能大大降低生产成本，使药品价格大幅下降。,设想二,能否让微生物产生出适合人的胰岛素等珍贵药物？,这些定向改造基因的设想能实现吗？,经过多年的努力，科学家终于在20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术 基因工程,基因工程的产物,基因工程的概念：,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,基因工程的概念：,定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。,普通棉花 抗虫棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,与运载体DNA拼接导入,棉花细胞(含抗虫基因),转基因棉花植株(有抗虫特性),上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,“分子缝合针”DNA连接酶,“分子运输车”运载体,1.1、DNA重组技术的基本工具,“分子手术刀”-“分子缝合针”-“分子运输车”-,限制性核酸内切酶DNA连接酶运载体,专一性，识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。,约4000种。,1、来源：,2、种类：,3、特点：,5、结果：,形成两种末端,一、“分子手术刀”限制性核酸内切酶,切割DNA,4、作用：,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,限制酶在原核生物中的作用：,寻根问底(P4),你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？,限制酶的识别特点,以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列 如：GAA TTC CCC GGG CTT AAG GGG CCC,（专一性）,观察切割位点,大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端。Sma能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平末端。,EcoR,黏性末端,黏性末端,中心轴线两侧切开,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,Sma,平末端平末端,中心轴线处切开,什么叫平末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,思考与探究 P7,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,3、特点:,4、作用：5、结果：,1、简称：2、分布：,工具1：限制性核酸内切酶,主要在原核生物中,限制酶,识别特定核苷酸列,切割特定切点,（专一性）,切割DNA,产生黏性未端或平末端,小结,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,思考?,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,EcoR,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,不同来源的DNA片段混合,将不同种来源的DNA片段连接起来,生物A基因片段,生物B基因片段,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,酶切割,基因的针线：DNA连接酶,二、“分子缝合针”DNA连接酶,作用把2个DNA片段末端之间的 缝隙“缝合”起来。,限制酶切割后有两种不同的结果，一种产生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的连接时，所用DNA连接酶是否一样呢？,DNA连接酶的种类：,大肠杆菌,T4噬菌体,？,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，也 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,寻根问底(P6),DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,作用 对象,DNA复制,基因重租,DNA连接酶与DNA聚合酶比较：,单链,双链,3、类型,E,coli,DNA,连接酶,来源：大肠杆菌,作用特点：只连接黏性末端,T,4,DNA,连接酶,来源：,T,4,噬菌体,作用特点：连接黏性末端和平末端,2、作用原理：,催化磷酸二酯键形成,1、作用:：,工具2：DNA连接酶,把DNA片段拼接成新的DNA，,4、DNA连接酶与DNA聚合酶比较,小结,例.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段:你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？,和能连接形成,和能连接形成,和能连接形成,和能连接形成,反向对称,DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,思考与探究 P7,要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！能将外源基因送入受体细胞的工具就是载体。,基因工程的载体来源：,作为基因工程的载体需要怎样的条件呢？,质粒、噬菌体、动植物病毒,作用：将重组基因导入受体细胞,三、“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,论一论,2、能否用SARS病毒作为基因载体？,3、作为载体，若没有切割位点将怎样？,4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？,5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？,1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？,双链DNA,不能,不能进行DNA的重组,载体上应有标记基因,可能造成基因丢失,1、载体必须具备的条件：能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；具有一至多个限制酶切点，以便与 外源基因连接具有某些标记基因，便于进行筛选。如：抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。对受体细胞无害,2 常用的载体：质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等,认识常用的载体质粒,质粒是基因工程常用的载体，一种裸露的、结构简单、独立于染色体或细菌拟核之外，能自我复制的小型环状双链DNA分子，对宿主细胞没有影响，主要存在于细菌和酵母菌体内。其中最常用的是大肠杆菌质粒。,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因,3、质粒,本质：小型环状DNA分子。,分布：许多细菌、酵母菌等生物,质粒的特点：,1、细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的小型环状DNA分子；2、质粒的存在对宿主细胞无影响；3、质粒的复制只能在宿主细胞内完成。,1、能自我复制2、具有一个或多个限制酶切点3、具有遗传标记基因4、对受体细胞无害、易分离5、大小适合，便于操作,质粒作为运载体的条件：,在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。,工具3：运载体,1、需要的条件：有1多个限制酶切点能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞的 染色体DNA上复制有某些标记基因，便于筛选 对受体细胞无害2、常用运载体：质粒、噬菌体的衍生物或某些动植物病毒3、质粒：小型环状DNA分子。,小结,天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？,不可以，作为基因工程使用的载体必需满足一定条件,且都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,思考与探究 P7,原核生物很容易受到自然界中外源DNA的入侵，但是长期的进化过程中，这些原核生物却没有因为外源DNA的入侵而灭绝。根据我们刚刚掌握的知识，你能推测这其中的原因吗？,原核生物细胞中的限制酶会将外源DNA切割掉，使之失效，以保证自身的安全，但是不会切割自身的DNA，这是原核生物在长期进化过程中形成的一套防御机制。,寻根问底：,本课知识回顾,基因工程又叫做 或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种 提取出来，加以，然后放到另一种生物的细胞里，改造生物的遗传性状。,基因拼接技术,DNA重组技术,基因,修饰改造,定向地,DNA 重组技术的基本工具,“分子手术刀”,“分子缝合针”,“分子运输车”,限制性核酸内切酶,DNA连接酶,基因进入受体细胞的载体,限制性核酸内切酶,主要是从 的一种酶。识别双链DNA 分子的某种，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断开。形成两种末端,原核生物中分离纯化出来,特定的核苷酸序列,磷酸二酯键,粘性末端,平末端,“分子缝合针”DNA连接酶,1、种类：2、作用部位：,连接黏性末端,Ecoli DNA连接酶,T4 DNA连接酶,磷酸二酯键,连接黏性末端和平末端,基因进入受体细胞的载体,通常有三种:作为载体的条件：在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是在,质粒,噬菌体衍生物,动植物病毒,天然质粒,人工改造,的,能自我复制；有切割位点；有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离,基础上进行过,2和7能连接形成ACGT TGCA；4和8能连接形成GAATTC CTTAAG；3和6能连接形成GCGC CGCG；1和5能连接形成CTGCAG GACGTC。,教材P7思考与探究1,1、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同种限制酶 B.两种限制酶同种连接酶 D.两种连接酶,反馈练习：,2、不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制（）B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,4、下列说法正确的是：（）A、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、重组技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、运载体 D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程可称为“克隆”,5.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,6、关于限制酶的说法中，正确的（）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的是GA之间的氢键C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中,7.（多选）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传 性状，培育生物新品种 B、重组DNA的形成在细胞内完成 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体,BD,8.下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是（）A B C D,9、以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：GC AATTC GC CTTAA CG G CG G,(1)其中和 是由一种限制酶切割形成的 末端，两者要重组成一个DNA 分子，所用DNA连接酶通常是。（2）和 是由另一种限制酶切割形成的 末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常是。,反馈练习：,谢谢观看！,