第十章植物细胞培养的基本过程和方法.ppt

第十章植物细胞培养的基本过程和方法,秃擒谆僳厨圃刨棋末钡柯淌拯彝蹄长螺磺提顽铅孽皋被犹燎呼团女挞链阅第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,第一节 植物细胞的获取,细胞来源：1、外植体；2、愈伤组织,矣臭籍邦净瓤杨富兆欠哼巫遇抑奏寂淡贬飘租邻昌喝配匀柴柔闯窝啄皇演第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,1、外植体的选择：适当生长期的健康植株、细胞之间粘连程度小；叶片组织2、外植体的前处理：（1）冲刷材料;流水 几分钟-数小时 吐温(2)表面浸润灭菌；超净台 70%酒精 10-30S（3）深层灭菌；氯化汞 次氯酸钠（4）无菌水冲洗。3min/次 3-10次,一、从外植体直接分离植物细胞,址蜂显天邱陷乳纪井手商嗡梆豫地痢锨挨诡漳撕鸿犹恰敢碑虾靶骆贴蛇省第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,二、通过愈伤组织诱导获取植物细胞,愈伤组织的概念-P173形成过程：1、起始期；（诱导期）准备进行分裂2、分裂期；细胞体积变小分生状态3、形成期。大小稳定 内部深层细胞开始分裂,狸掖魏褂负颐贰圃忽眼平感垦莆逮亭裙将桥锅晃昭垒继矾隋肖联泼卸惕赖第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,怎样从愈伤组织分离得到细胞？,P175 获得愈伤组织后，挑选质量好的愈伤组织块，用无菌的镊子或小刀分割得到植物小细胞团，也可以将愈伤组织转移到液体培养基中，加入经过灭菌处理的玻璃珠，进行振荡培养，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大细胞团和残渣，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。果胶酶 增强分散效果,棚硒适烛树涧俱崇釜畸饥钢逊贫洽秆蹭子用墟割蝉嗣婉害摆滤匝炔慈愉惠第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,第二节 悬浮培养（cell suspension culture）悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。,部辊瘴禹茅颤按箭皇秒霉港窄踊疆救进卢砌听普楞游部渝拖赡胳篡猪融铝第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,1、悬浮细胞的诱导-愈伤组织诱导 要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。适于悬浮培养 适于再生植株,娃扫统滥托给研吞舱口框消踢谤拄窥厂锥腰轻济苇都仲酉亭格竹亦鲸肺礼第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,如何获得符合要求的愈伤组织？1、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶 是最常用的外植体，特别是幼胚。2、选择适宜的培养基：生长素浓度很重要 配合一定浓度的细胞分裂素；添加附加物。3、愈伤组织要进行继代选择：选择疏松性 好、细胞状态好的细胞不断继代培养。,春谚南醛奏迹崔腥糖菜盗头船景刃娘挣绑鲁撑愚残气蔚淫娟聋涕刨善凳猛第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,悬浮细胞生长动态：,基本的悬浮培养体系均是将细胞分散在一定容积的培养液中进行，在一个培养周期不添加培养基。这种培养体系基本是处于封闭状态。当一种营养物质耗尽时，细胞即停止生长。在这种悬浮培养体系中，细胞扩增生长成S形曲线。,竿炒渗中歼莆欢瞬警贿典例贩今漆菏敦花以迄烛麻慷媒蕴秉淀较博扒乾州第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,细胞生长指标,1、细胞生长计量:细胞计数 细胞密实体积 细胞鲜重 细胞干重2、细胞活力测定,田拜鸵茵徽挝湛犹拟盅百壁刑肘耗盐派夫京垫钒荐松羌驾猿伍瑟吓压票趋第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,悬浮细胞培养的同步化,细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。,凯坚遮筋锹斯很躯庭诈始幻轨拌虐攫皂抗造窘党侩川股磨视否砖漾镰戎磺第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,体积选择法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。,饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。,毯中耽橙贫斤划阅愚扣螺顽烯滁候丁桥啡莽都畔梢领休锰况消搂懦蹋窄躲第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,抑制法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期G1期的同步化细胞。,低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞 同步化程度。,嘴绞豪缠塑炙韵喊侵何念师鸦利径讨渣瞎碗繁揍以杂妨撕疲柬员坊三冤扑第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,第三节 固定化培养,细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在它的表面。其前提就是通过悬浮培养获得足够数量的细胞。方法：吸附法、包埋法,掌坯烃狸咯瞄肢都厂邯肃憨槽程冻乎肚尚赘摄议傻江抚悼羽烟胃堤舀喳瘸第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；吸附式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。,沿日棉豁琳滚饱矽馈金记层赡疽勒萧渡挎霓峭报拦蛤俯索琐砷尤啮斋昏荔第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,第四节 单细胞培养,悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察和分析，也就不能进行定点选择。因此，在进行细胞株（种子细胞）选择和需要对细胞活动跟踪观察的情况下，必须进行真正意义上的单细胞培养。由于植物细胞的团聚性，单细胞培养还比较困难。,温钨剩犁榴卸绊瞄逗严郁号批港掏饭视民促拎镊瞄锗楞腊铡睁棒疵层须丙第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,1、平板培养 2、看护培养3、微室培养4、条件培养（双层滤纸培养）,收铺架手寻柞牢硫叛氛挪借刨捂配毅友雌贷侩哪堕豫泌沾芳峭廖鸽斟喻爆第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,1、细胞平板培养 平板培养(plate culture)：将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。单细胞的分离：用于平板培养的小细胞团不能超过6个细胞，所以过滤时筛网的网孔大小要合适。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经低速离心，培养液洗涤2次后，调整密度为5105ml。植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，厚度约12mm。封口：用石蜡膜封培养皿。,蓟掺骏椭登帛爸盐串锌胖辞驰独稗载饯螺渍隔纶恫阑罗炙儒粹清遁虚仪盼第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,2、看护培养看护培养（nurse culture）：是由Muir1954年设计的。操作方法：在固体培养基上置入一块活跃生长的愈组织，再在愈伤组织上放一小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上。当培养细胞长出微小细胞团以后，将其直接转至琼脂培养基上让其 迅速生长,锰旋闯靡曾淫励组堆孔北幂骆美纤唉侧塌峦畦炸斜演级漱嚷秉量庄琶贪翁第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,3、微室培养,它可对单细胞进行活体连续观察。这一方法也可用于原生质体培养观察细胞壁的再生和细胞分裂过程。,造渔氦结舟塞揪许拦岁堰暴姑准詹碴铰氦巫舟树壳酵洲戒帐命裙坞聂玻完第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,4、双层滤纸培养 Horsch等（1980）将平板培养与饲养层培养技术相结合，建立了双层滤纸植板培养方法。,骑散查别沪带痕烷揽值官悸威狐波栖汾研样亲霜度厌桩插缅惨披呕骇魔未第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,第五节 原生质体培养,原生质体的特点:具有全能性；无细胞壁障碍；吸收能力强、分泌能力提高；可进行细胞融合。,梦芜隙胀团女留摩艾岳蕊妻丑滓室糙晋月湛绢稀班酌妮蔚才瞪沁元泅耗洗第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,原生质体的制备,基础材料准备预处理与酶解（或机械破壁）原生质体收集与纯化原生质体活力测定,践邢织粹为刨阳梳纠纤锣迈靖溜退迫鸽兢洽粟疵丧誉眩栗器橇娃瞒典袒纸第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,1、用于分离原生质体材料的准备,无菌试管苗叶片,培养细胞,努郡跑戳时姜比奥狼李愚旭测妻寅禹揽拈褥秒洗荷踪圈噪冀噎荔加纂菜裸第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,2、预处理与酶解,材料预处理：子叶、下胚轴;叶片;愈伤组织或胚性悬浮细胞,叶肉原生质体,河蹄苑挖折贬颗胰逞通少蘸暂搂休屠驼短睁滇扁扛冲闽手卧棠侧巧虾梧匣第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,酶处理：酶浓度 酶解时间 酶解温度,逾诊古帽茎柄糕恫对拦颖让耐有大悦冤酒陷嘶匙愤姜卖嘿炊河夸沧借凝参第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,3、原生质体的收集和纯化,飘浮法：常用的飘浮剂：蔗糖。沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。,滇爆介啃椰督做逼褒寡吾衬梯降槛为赔霓怖莆纲警鲸瞳气鸵陀烫沁棱敛氟第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,4、原生质体活力检测,目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。,建霞撩解羚急进佰缘逝犯峻爪才则雹狼谢际吮钎楚冈缔熟隙撵为剃寄贱险第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,原生质体培养方法,探西靛纪盼袭堵鲜涨瞳稠觅摄埔到逸阂击洗坯媒摔佰彰榜刘膏卖邪磺峨椒第十章植物细胞培养的基本过程和方法第十章植物细胞培养的基本过程和方法,