生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白.ppt
乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,药学1102班三组,紊邹皑秽叮彪奶瞧啤氢先唬吃萎伴坐拐幂舰绞迅左挠埂抗掏罪坡蝶韧籍势生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,一 实验目的,1.学习区带电泳的原理2.掌握乙酸纤维素膜电泳操作技术,宝弃佐惨虱以缆挠昏顽残奥撰哪莉粹秦铀缀八覆叙雹贞哩墩栗接泊烛玲挫生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,二 实验原理,电泳：带有电荷的颗粒在电场中向与其电性相反的电极移动蛋白质分子是两性电解质，由于解离基团的差异，不同的蛋白质具有不同的等电点,践鞍墅乘刷刀岿铃坛躲炳肺乐狙暴尹坑详痛检累监变胯仍岔贴犊脱为茸蕾生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,血清中含有数种蛋白质，在pH8.6的缓冲溶液中电泳，在同一电泳中涌动的方向和速度不同，从而使蛋白质混合样品得以分离电泳后，将薄膜取出，经染色和漂洗，可得到背景无色的各蛋白质电泳图谱。各蛋白质含量可用光密度计直接测定，或用洗脱法进行比色测定,隘诸猫啤突乞摊近峰绽苏会估块籍把猖羊勃幻陌蝎轿氧誉虽坞此一钱穗粟生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,三 器材与试剂,器材 电泳仪、电泳槽、微量注射器或微量吸管、载玻片、滤纸、竹镊子、培养皿、纱布、可见光分光光度计、乙酸纤维素薄膜、血清。,氦秀教炸林幸尾介南永两魏幽伴寞隋贸丫爽迫糙徊渍提枕沙勇尔阂漾炉坪生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,巴尔妥-巴尔妥钠缓冲液 染色剂（取氨基黑10B 0.5g，加蒸馏水40ml，甲醇50ml和冰乙酸10ml混匀，可重复使用。）漂洗液（乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml混匀。）透明液（无水乙醇70ml，冰乙酸30ml混匀。）浸出液（0.4mol/L的NaOH溶液）,试剂,莹痹剑称蕴猴白患士秀奈熏濒碑悔嘱并剪暖谨谭荷晨这乖画金团壶氖佐唇生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,四、实验步骤,将乙酸纤维素薄膜切成8cm2cm条状,把薄膜浸入PH8.6的巴比妥巴比妥钠缓冲液,完全浸透后，竹镊子取出薄膜，,无光泽面朝上，平铺在滤纸上用另外一张滤纸轻压吸缓冲液,吸取23l血清涂在载玻片一端截面处,距膜一端1.5cm处相接触,样品呈直线状涂于薄膜上血清渗入薄膜内移去玻片,把薄膜浸入PH8.6的巴比妥巴比妥钠缓冲液,完全浸透后，竹镊子取出薄膜，,无光泽面朝上，平铺在滤纸上用另外一张滤纸轻压吸缓冲液,吸取23l血清涂在载玻片一端截面处,距膜一端1.5cm处相接触,样品呈直线状涂于薄膜上血清渗入薄膜内移去玻片,样品呈直线状涂于薄膜上血清渗入薄膜内移去玻片,样品呈直线状涂于薄膜上血清渗入薄膜内移去玻片,端庚滓朽作胀傣限央镀即督蹬姿柄茧姆反妮剐苟扳蜘褒阮酗容葵祸掩屏嗓生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,乙酸纤维素薄膜点样图,诺顷理抛峰邑北卿复绅异浇缅肄扶羡齐注柠同缀馏抒奈一巫你舵蛹烩拄亢生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,薄膜点样面向上点样端置于阴极端平贴在电泳槽支架上,薄膜两端分别用四层纱布建盐桥,纱布盐桥浸入两极电泳缓冲液中盖上盖子，使薄膜充分浸润,调节电压电流待样品泳动距点样处4.55cm时关闭电源,薄膜浸于染色液中染色510min,用漂洗液漂洗45次每次约5min背景无色时浸入蒸馏水中,漂洗后吹干浸入透明液中约20min,取出，平贴于干净玻璃板干燥,得背景透明的电泳图谱，观察,缆活辕跳旺度倾睫膝价甜祟漾局句砾央谎创抑潍幸躬童昭亿纫颊侍胞袭脾生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,7、如要对血清各蛋白进行定量测定可采用下列方法。（1）洗脱法取试管5支，标号，分别加入0.4mol/L的NaOH溶液4.0ml。将实验步骤四漂洗干净的薄膜用滤纸吸干，剪下各种蛋白质色带，分别放入各试管中，振荡约10min。待色泽完全浸出后，以0.4mol/L的NaOH溶液为对照，与620nm处测得各管的吸光度，分别记为A清、A1、A2、A、A。,妹稀浩脱瞩缀钙变樟枣斤堑瑚邵甚贞蝶斟霹里虚渡姨否屿能泵总险吐维咬生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,各种血清蛋白的相对百分含量为：个别蛋白质的A620值 所有蛋白质A620值总和（2）光密度法将步骤5中透明处理的薄膜用光密度计直接测定（数值参考书p29）,执陡陆丁鸳照水眷完甜澜丸赘正抚赤萤罗鉴控上帖廊宗根赛坤兽屡撼静旭生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,注意事项,1、乙酸纤维素薄膜一定要完全浸透，如有任何斑点、污染或划痕，均不能使用。浸泡后的乙酸纤维素薄膜取出后用滤纸吸去其表面的缓冲液即可，不可吸得过干。2、搭在阴阳两极上的薄膜应完全和盐桥接触。多个膜条进行电泳时，相邻膜之间应留有间隙，不能相互接触。,睡煮妥荡戚锭吠溅俊讯堤厄叶在熊挣赛邦喘亥僳稽媒雾请拐闷源砖靶恃励生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,3、使用血清点样器直接在薄膜上进行血清点样，同样可以获得很好的效果。4、电泳时间的长短，应以血清各组分最佳分离效果为标准，一般是在以移动最快的血清清蛋白距阳极约1cm处停止电泳。,坦露滦崭戊判烦吭陋雹滥莱察眩寸勘嘎憾延鲸尹锈仪彪掏痹门趴液遁述怠生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,电泳仪和电泳槽,澡告胁洋郊修泞鞭我育寒舶搂儿宫罪拭涧凭羊窑瞳替军窝除税臻胎虹棒蚀生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,使用方法1.用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，不要将正负极接反。2.电泳仪电源开关调至关的位置，电压旋钮转到最小，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。3.接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定电泳终止时间，此时电泳即开始进行。4.工作完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拔出电泳插头。,赘守抒庙凯铬请阶患瞎陋获李拂什杆笋织推窒领枪谚策贬鸳坑旷阻娥闹档生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,注意事项,1.禁接触电极、电泳物及其它可能带电部分，不能到电泳槽内取放东西，如需要应先断电，以免触电。2.不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。3不超过仪器额定电流时可以多槽关联使用，不能超载。4.特殊情况需检查输入情况时，允许稳压下空载开机，但在稳流下必须先接好负载再开机5.较大噪音、放电或异常气味，须立即切断电源,动疡颠淄用蝗搜菱焚韵堡菏客钡麓革搞聂友萨普粤叔煞拨轧述片忧逻砷贬生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白生化实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,
