实验5琥珀酸脱氢酶ALT.ppt
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制,生物化学与分子生物学系陈园园,实 验 7,修郡丽品牛寒弟雅危贯歹念彩尚毫啥悬侮弱拨丢礼中挽搅凡技棍嫡蛀害装实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,了解琥珀酸脱氢酶的作用及 酶促反应中的竞争性抑制作用,实 验 目 的,骏蒋鹰像直模眠抑甜饿端砸田丧诈汐炊瞒纷占评府系劳似喝莹傍奠沥挎泽实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,竞争性抑制作用,抑制剂和底物的结构相似，能和酶的底物分子竞争与酶的活性中心相结合，从而阻碍酶与底物结合形成中间产物。,壳院跟凯则斤硅托辣居衙袱敢夏掉宇览蚊籍烘艾模捅四缠榷颗雹夫侧丁祝实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,抑制程度取决于抑制剂和底物对酶的相对亲和力 以及抑制剂和底物浓度比。加大底物浓度可减弱甚至解除抑制作用。,忠丽酌泛咱匿页激哑酱亨粒绘妒迟啤低背坞窟吐艰铱丁脾验碎谓撑裙哥督实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,实 验 原 理,延胡索酸,琥珀酸,还原型甲烯蓝(白),琥珀酸脱氢酶,甲烯蓝(蓝),E+S ES E+P,琥珀酸,丙二酸,E+IEI,琥珀酸脱氢酶,FAD FADH2,惭婆但亥斑脉距饵前莹坞矫嚏茨番痢发塘烷宜完微简涨杠甩药鸥反伺磅阴实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,操 作 步 骤,1、酶提取液的制备 11.3 g 兔肌肉(剪碎)海砂少许(1/3匙)+2ml 磷酸盐缓冲液(1/15 mol/L)，研磨成糊状，然后再加10ml 磷酸盐缓冲液(1/15 mol/L)混匀。2、纱布过滤（双层）3、取小试管五只，按书上P40表格加入各试剂。最后加石蜡隔绝空气，37水浴保温。每间隔1015min观察一次结果，并记录。,柑屠猪轨簧烬本拆锈对僚旦锰队惩琉责叙第燎荔紊卧阁碉墙尉骂杰倚梳田实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,实 验 结 果,淄渤牡滩虹嫡赦谨杭抗迎迟魁南网武恩凉谩绝灯薄鄂奋践好皇竹劳幸檀量实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,浊裤骇练酝低敞廖象讽伺铃重摇葛各皱版耐痉芒令嘉慰笨皖败哨稗瓦甘抱实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,注 意 事 项,注意区分肌肉与筋膜；家兔肌肉必须充分剪碎碾磨，海砂不可加太多；12 ml缓冲液要分次加入，不可一次性加入；碾磨器械、纱布要及时清洗，纱布要洗干净晾干；滴加试剂时，一定要看清试剂的名称和浓度；滴加液体石蜡时沿着管壁倾斜加入，盖住液面即可；观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧化变蓝；实验完成后试管要用皂粉清洗。,旱穆测志您监遮廖延煮磁岳城婉外宝帜屁智孤角鸡见势垢燕茂竹急哼脂琼实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,改良Mohum法测定鼠肝谷-丙转氨酶(GPT)活性,实 验 22,愿讨甭娜毁陪筹艾屠晌衣琼冷坞底慷严掸邯倔腿矿裙挝懂折锚种属悼卿汇实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,实 验 目 的,掌握GPT活性测定的基本原理熟悉GPT活性测定的具体操作方法了解血清GPT活性测定的临床意义,附易所臆骤褪帚矾蘸伞砷湾胖磕证唬掂示坎系唤叔狙躯塔烤郴彩骗爆莆锁实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,实 验 原 理,GPT,2,4-二硝基苯,丙氨酸丙酮酸,-酮戊二酸谷氨酸,在520nm波长测定其光密度，与已知浓度的丙酮酸溶液比较，即可计算谷-丙转氨酶的活性,丙酮酸二硝基苯（碱性溶液中呈棕色）,裸患斌午们塘储荆浊他墅烛鹊胃缔熟蠕恨附灶杠堰沏皆微冬秀貉紊孙匆秋实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,血清谷-丙转氨酶活性单位,在pH 7.4、37条件下，每毫升肝匀浆与底物保温30min后，每生成2.5 g的丙酮酸作为1个谷-丙转氨酶的活性单位，血清中GPT正常值为2-40 U/mL。,枉唐武朽鸟停祷减映铆脑昨羚与权题炳攒左夕竿鳃指客店征碧汲皂帧孝采实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,实 验 步 骤,标准管法测定酶活性：1、取干燥试管4支，标号 测定管 对照管 标准管 空白管2、依次加入试剂，混匀，37保温3、呈色反应后，520nm比色测OD值,郸赚具喳郎预榨粘旧曙店芍虽瘫蛛钩辣婿焊刺引嫩呕候诣膳镜幻郎螺真鬃实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,谷丙转氨酶活性单位/mL鼠肝匀浆=?U/ml,方法一：以空白管调0，测A测定、A标准、A对照,实 验 结 果,A测定测定管中生成丙酮酸的质量=m标准 A标准,A对照对照管中生成丙酮酸的质量=m标准 A标准,30min中生成丙酮酸的质量=m测定 m对照 A测定-A对照=m标准 A标准,30min生成丙酮酸的质量 1活性单位=2.5 g V测定,峰乳氦宅汲织海迸吗即娥殉邮念咸沫蚌另饰阮醒舶弓茨捆藩篱铝由禹奴今实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,方法二：以空白管调0，测A标准 以对照管调0，测A测定,A测定 m标准 1 A标准活性单位=(U/ml)2.5 g V测定,损读鹊妄赶寇芜甄江铃磺潭漏远庆汇返闷足喜匠峪款贫卯闷速坪跌友夹壳实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,注 意 事 项,保温温度和时间要精确，即酶发挥催化作用的环境要一致。2 掌握酶活性单位的概念和计算方法3 微量移液器的使用,丰琳吩巫痉扩抨衍尼退紧柏傻害夜宇型外劲铲觉笔肝吐掣棕矽辰黍喳讳泰实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,分光光度计的使用,1.打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热2030min2.1档（空白管），T模式调100%，显示“Blank”、“100”3.拉杆拉至1.5档，T模式下调0%，显示“0.00”4.换到A模式，拉至2、3、4档，读取各个样品的吸光度,拉杆，1-4档,样品池,读数,波长,毛面,光面,1、分清光面、毛面。手应接触毛面，光线从光面通过2、用溶液润洗2-3次，装至2/3至4/5体积3、粗纸吸水、柔纸擦亮光面,比色杯,局沪碑盒伸成炎堪脉仲汗豺咳毙穿兽尔耻羔鉴滋做肄篓苗妹同些那售磋烙实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,ALT测定的临床意义,用本法测定血ALT正常值为40 U/ml以下,肝细胞中ALT最丰富，当肝脏疾病致肝细胞受损时，ALT即大量释放入血液，致使血清中ALT活性增高。测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死；中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎；轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。饮酒、油腻饮食、过劳等因素也会导致ALT短暂增高,瞪后描株去汝韩板蛀甭冉豫叠惦搬卸程猩孔卿镶吴磨信岿石庭燥拇拖砂西实验5-琥珀酸脱氢酶ALT实验5-琥珀酸脱氢酶ALT,
