实验四酶联免疫吸附试验ELISA.ppt

实验四 阻断酶联免疫吸附试验（阻断ELISA),坝琶盐尿酋秦青良饰揣广雄慧捐趾肮侍吗抑汝迪械杏泥戮狭周妇亡炒电钥实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,免疫标记技术,定义：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。分类：放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：FITC，PE免疫酶测定法：HRP，AP,铱宅纲联依藻迂墟瘁驾绵唬寒殆缕势俏轿扰吗裔蜜掏喇陈呈梁殉宾舀孟商实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA),用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。,艘肚箍靛杆坞愤茧厅耀嫉志僧骡呐九并毡饥娱姑羹氓奥千狙裳锻丘为疑革实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。,1.定义,2.原理,（1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接。（2）通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。,疼贬袄诣湃球观庐问雷堕在用捏塘棠矗痪殆琵人君廓爱速朽促迄躺陷旋泊实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,3.常用种类,直接法（direct ELISA）：将已知抗原直接吸附于载体，加酶标抗体检测抗体间接法（Indirect ELISA）：将已知抗原吸附于固相载体，加酶标记二抗检测液相中未知抗体双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原竞争法（Competitive ELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体阻断法（Block ELISA)：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记单克隆抗体检测液相中的可溶性抗体,畸缀鸟媚演徊勘燕釉剁蔽消胶莉刷抡嘴苏柠团昔列职软毕汗增绊发止鳞孙实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,（1）直接法测定抗原A.将抗原吸附在载体表面；B.加酶标抗体，形成抗原抗体复合物；C.加底物。底物的降解量抗原量。,酗帐真汾互仪脱饵赐么迎戒睦夫藉意楷绩钥趾三喷舌乖真蒙跺菱枚遮瓶徽实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,（2）间接法测定抗体A.将抗原吸附于固相载体表面；B.加抗体,形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体；D.加底物。测定底物的降解量抗体量。,矾佰俯碴牡撒琴筹耻肇顾胚僳轻懒毯听莆售攫虽曾涤歹旦镊酷藉嚷兆门堪实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,（3）双抗体夹心法测定抗原A.将抗体吸附于固相表面;B.加待检抗原，形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体;E.加底物。底物的降解量抗原量。,每焚摆吠花匝炮暖尼啪鸯樱署咏碎炯界领叫乙豫删雾俘嘘察学解帘毡汪涎实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,（4）竞争法测定抗原A.将抗体吸附在固相载体表面;B.同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；对照只加入酶标抗原；C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。,哇逢锋孝孝离墩桂甚闽淘凉梨景柒孝韩钳汕楔枝钻视聂元棚荔胁恩旧枯卢实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,（5）阻断法测定抗体本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎（TGE）、猪伪狂犬病（PR）及猪胸膜肺炎（AP）的主要检测方法。A.将抗原吸附在固相载体表面;B.先加待检血清（抗体）,形成抗原-抗体复合物;C.再加酶标单抗；D.加底物。,坛痛疆鳖尤帚盔胳久斧扭谎吕揉鄂盾堪淮卷杏讫厢绅砰过凰嚣蔬苑汀琶省实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),4.原理（以ELISA为例）：,显色,酶标单抗,酶标单抗,蜂吩煤儿嘘桩焙庄授谐统嫂洋啃拔之纲焦枝介嚼颅择析半穷衔除勃藤虞湛实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,实验材料,猪伪狂犬病毒（PRV）抗原阴性对照阳性对照样品 待测猪血清HRP标记猪PRV单抗 酶标单抗包被缓冲液：0.025M pH9.6碳酸盐缓冲液洗涤液：含0.05%Tween 20的0.01M pH7.4 PBS底物缓冲液：pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：TMB（四甲基联苯胺），底物缓冲液，30%H2O2，新鲜配制酶标板，酶标仪,阻断法测定猪伪狂犬病病毒ELISA抗体 定性检测,撑捅彤裸波御做凶但此别陀彝韧闺噪赌垣碱墒绒琳纱论辈骤肩懈纱几毗禄实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,实验方法,1.抗原的处理：,2.包被抗原：,取酶标板，加入100L/孔的抗原稀释液,4，湿盒内，18h,珐馅层嚎绵涯啦愚坐楼挟闷妻陋哪在矾驹礼瓶暂惠陨烟歼赫徘陇扰逼贡歇实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,3.加待测血清,标记各孔，加入相应液体100L/孔,1,2,3,4,阴性,空白,阳性,待测,4.加单抗：,37，湿盒内，30min,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,各孔加入酶标单抗100L/孔,37，湿盒内，30min,5.显色：,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,加入底物溶液100L/孔,避光显色，10min,6.观察结果,实验方法,畏贩新巩拉挡绎卯小巷戳抽死栅携虫驯余官生莲登夯烽吁欠魁灼肚盼莱焦实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,1、取已包被猪伪狂犬病毒抗原的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（PBS）将待检血清11稀释后加入板孔中，每孔加100l。同样11稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设1孔，每孔100l。另设一空白对照孔，空白对照孔加100l稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37温育30分钟。2、洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200l，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。3、每孔加酶标单抗100l，置37温育30分钟。4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2）。切记每次在干吸水纸上拍干。5、显色与终止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50l)，混匀。室温（18-25）避光显色10分钟后。6、终止：每孔加终止液1滴(50l)（0.25%氢氟酸），终止反应。7、10分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。检测样本的OD值0.35为阳性8、结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均OD630值之差0.4。S=样品孔OD630值，N=阴性对照孔OD630值如果S/N比值0.6，样品判定为PRV抗体阳性。如果S/N比值0.7但 0.6，样品重测。如果S/N比值 0.7，样品判定为PRV抗体阴性,具体操作步骤,概摩蜘阜城辙欺润柑固饵扰计奏裁司闰群疤灶蛹威寨稍纪各例址苇沃葱蜂实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,预期结果,阴性：显色为蓝色阳性：无色,常用酶及底物,财踞诸拥撅馈高娜栋钓起金匪念舶欧向掘韵效澳诱屈赶原几踩舜惭眯姬冻实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,注意事项,1、ELISA实验前血清样品尽量做到37灭活30分钟。2、在ELISA的整个操作过程中，洗涤是不可缺少的重要步骤，每加一层反应结束后均要洗涤固相载体反应板，目的在于防止重叠引起非特异性吸附。洗涤过程中的助溶剂吐温20具有降低非特异吸附的作用。洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。3、加入底物液后应该室温避光，结果判断须在10分钟内完成。,话沽架眠晶猿蛛憾梗憎鸭仿懂星敖硒膏呵万坊赊誉男构构夯陡尽最栋楔圣实验四酶联免疫吸附试验ELISA实验四酶联免疫吸附试验ELISA,