酶促反应动力学多底物动力学.ppt
第二节 多底物反应及其动力学,一 反应机制的分类：(一)Cleland表示法的基本符号和概念：底物：依照底物与酶结合的顺序依次用 A、B、C、D表示产物：根据产物从酶上脱落的顺序用 P、Q、R、S 表示游离酶：E、F、G抑制常数：KiA、KiB;KiP、KiQ 米氏常数：KmA、KmB;KmP、KmQ 抑制剂：I 修饰剂：X或Y反应分子数:Uni(单)、Bi(双)、Ter(三)、Quad(四),西经赌保擞隅钦艳傀你鄙皑洒韦例转竣瘤瀑卸吭缓嫌克惰呐仇独曰鸥取茹酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,酶反应中间物：分为两类(1)稳态中间物：指酶和底物以共价键结合形成的较为稳定的中间物。可以发生双分子反应而不能自身解离。例如：某些Ser蛋白酶在催化过程中形成的酰化酶中间物 包括：共价结合的ES中间物；自由酶(2)过渡态复合物：非稳定的酶中间物，本身可以单分子解离或异构化之后再解离出产物或底物。分为:非中心复合物：酶未完全被底物饱和 中心复合物：酶已经完全被底物饱和，(EAB EPQ);(EA EP),抨局带畴痘较电户啪疫沦霸血凹沧饶兆汀奉椒叔轨泥矾资探爹葫雾廷造特酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,(二)反应机制的分类和命名(以双底物双产物反应为例）：1.序列(sequential)反应机制:酶必需与所有底物都结合之后才有产物放出。对于双底物双产物反应，必有酶-底物三元复合物形成。根据底物及产物与酶的结合及释放是否有序分为:(1)有序双双双底物双产物反应(ordered Bi Bi)：A B P Q E EA(EABEPQ)EQ E EA、EQ:非中心复合物；(EAB EPQ):中心复合物 A：领先底物；B：随后底物,迅佯驼郎寞奔吉剿撂裁鞋韧匆荔屋扎衅映爪鲍削娟帖煽锣膀拆裤陕偷涤黍酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,例如：许多以NAD+或NADP+为辅酶的脱氢酶类，乳酸脱氢酶（LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)等 NAD+苹果酸(MA)草酰乙酸(OAA)NADH MA OAA E ENAD+(ENAD+E NADH)E NADH E NAD+/NADH 形成外底物对机制：由于底物A与酶结合后改变了酶的构象，使 原来隐蔽的B结合位点暴露，B才能结合上去。暗示：A与B可能结合在酶的不同部位。,供闽腑履龙酋勿伟萤廓丧欲安欺筋址盒炮骆道杠联盒蛛侵溅嫡钩酚寓起壁酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,(2)Theorell-Chance(T-C 机制)：A B P Q E EA EQ E 第二个底物B结合及释放非常快，没有明显的三元复合物变构过程。可看作是三元复合物浓度极低的序列有序机制。例如：马肝醇脱氢酶：NAD+乙醇 乙醛 NADH E ENAD+E NADH E,竖浦盎愉踪揍看鞍择稼揖埂缄鼓尘简败抵窜点渠夹找普险揣莫塘淘狗毙冗酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,(3)随机双双(random Bi Bi)：A B P Q EA EQ E（EABEPQ）E B A Q P 产物从酶上的释放及底物和酶的结合无一定顺序。少数脱氢酶和一些磷酸激酶属于该类，例如肌酸激酶:肌酸+ATP 磷酸肌酸+ADP机制：酶蛋白上的A、B结合位均处于暴露状态，两者与底物的结合即互不干扰，也不互相依赖。,EB,EP,桌筛集水支印褥绦龟辫明淬嚎励勋温穷歹意檬硬肠识桥亚详屑处棍坐丸拣酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,2 乒乓机制(Ping-Pang Bi Bi)：各种底物全部和酶结合以前，已经有一种或多种底物放出，不形成三元复合物。A P B Q E(EAFP)F(FBEQ)E属于该机制的酶大多数具有辅酶，如转氨酶、黄素酶等。谷草转氨酶属于典型的乒乓机制：Asp OAA AKG Glu ECHO(ECHOAsp ENH2(ENH2AKG ECHO ENH2OAA)ECHOGlu),辑替蔡惫藤彬揍搽贯且犯诀造阎旷失具讽蓄每鸟锦拆浸檬懊元娄坞泄任翌酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,总结：有序机制 序列反应机制 T-C 机制 随机机制 乒乓反应机制,颠痉廉近扎涂蹬买偷灯以榔停驼饱涣体驴寇火锣换膛歪俱肩氧邑胡钠狸镇酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,二 King-Altman法速度方程图示法,(一)Kappa表示法:E+A k1 EA 1 k-1 2 Vf=k1 A E;Vr=k-1 EA Kappa()=速度常数项 底物(产物)浓度项 正向反应的Kappa：12=k1 A 逆向反应的Kappa：21=k-1 反应速度：Vf=12 E;Vr=21 EA 具有方向性，是一个矢量。其方向与酶形式的 流向有关,搂徊述狄刽即丝宙洽辅阶咨融债感洼沂皂抠垂健沦足忆组沙顾腆愁痞筑煎酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,(二)King-Altman 法步骤:,(1)首先写出反应历程，然后将反应历程安排成封闭环形式。环的角数就是酶存在形式数目，用n表示。然后在各角之间连线上标出各步反应的。E+A k1 EA k2 EP k3 E+P k-1 k-2 k-3 E k1A EA k-1 k-3P k3 k2 k-2 EP,整睦鸥啄泛傲蕴学埋锄蛹逗樊玻岸踏紫肢健路纶掇倡到甄翔亏蛰卸蹬根利酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,E=k-1k3+k-1k-2+k2k3 EA=k1k3 A+k1k-2A+k-2k-3P EP=k-1k-3P+k1k2A+k2k-3P,E:,EA:,EP:,（2）画出King-Altman 图形，即：所有流向各种酶形式的n1 线矢量图，再将各步反应的标到矢量图上,并写出流向 各种酶形式的乘积之和。,挥离遂捎钾咏笑饱停慈浸偶苔竖滔太腋维须蹋细碌理共峪广属慕碍耻滇许酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,（3）速度方程推导:各种酶形式的浓度与其乘积之和成正比:E E;EA EA;EP EP E0=E+EA+EP E=E E0 E=（E）E0 EA=EA E0 EA=（EA）E0 EP=EP E0 EP=（EP）E0,泣九面趟筐没敌法足掣龙搔强棘咬币复倡顽谐绷驹赁募饱克爷馁浇斜临强酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,V=k3 EPk-3 E P=(k3EP/k-3 PE/)E0=(k1k2k3 A k-1k-2 k-3 P)E0(k-1k3+k-1k-2+k2k3)+k1(k2+k-2+k3)A+k-3(k-1+k-2+k2)P=num1A num2P const+coefA A+coefP P num1:分子中A项之前的系数乘以E0 num2:分子中P项之前的系数乘以E0 const:分母常数项 coefA:分母中A项之前的系数 coefP:分母中P项之前的系数,予林击国绩扫目吁型搽湖慢吞脆台萤吝驾窟愈嘶孔股相钩朽龋契妓扬兄狗酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,(三)注意:矢量图数目的计算:n-1线矢量图数目=m!(n-1)!(m-n+1)!n=角数;m=封闭环的线数,n=3;m=3;n-1线矢量图数目=3!=3(3-1)!(3-3+1)!,宣谗括椒蒸俯签慎孝愁俗师宋鲜哲紊韦屯琴欲坍柠丈案属救蔫识虎锅货痪酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,King-Altman 图形不包含封闭环形式：E1 E2 E3 E4 n=4，m=5 n-1线（3线）图数目=5！=10个，(4-1)！(5-4+1)！2个封闭环形式无效，应去除。共有8个有效的 King-Altman 图形,吩神锥漠谦袋求徒耸裂捍们慈进薛惮悲酷削恕枢承载忌淘睹靛坐卜巫载佳酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,反应历程中有时可能没有逆反应，此时有些 King-Altman 图形不存在。E+A k1 EA k2 EP k3 E+P k-1 k-2 此反应若没有k-3 线，则某些King-Altman 图形不存在，反应速度中凡是含k-3 项 者不存在。,誓绕窄芦战詹涵肆互房陀撵因彩歹菱蜕壤卫畏勾言粥浆函绰勤惮翌纽玻祝酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,E:k-1 k-1 k3 k3 k-2 k2 EA:k1A k1A k3 k-2 k-3P k-2 EP:k-1 k1A k-3P k2 k-3P k2,E=k-1k3+k-1k-2+k2k3 EA=k1k3 A+k1k-2A+k-2k-3P EP=k-1k-3P+k1k2A+k2k-3P,曳骂睦蛆畸骋帖驯批尔烯传幌馒镶反鸽随感萨瓢曹炮丽琢奴遥归道泞肄蒂酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,V=k3 EPk-3 E P=(k1k2k3 A k-1k-2 k-3 P)E0(k-1k3+k-1k-2+k2k3)+k1(k2+k-2+k3)A+k-3(k-1+k-2+k2)P=num1A num2P const+coefA A+coefP P,萧荐哗症椒口蓖轻痴丈锭讲坯若字馋疤演夹甚姥羡绍娃勿湛啼零努韭莽卞酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,三 双底物反应动力学,(一)有序双双机制：1 方程的推导：E+A k1 EA+B k2(EABEPQ)k3 EQ+P k-1 k-2 k-3 k-4 k4 E+Q E k1A EA k-1 k4 k-4Q k-2 k2B k-3P EQ(EABEPQ)k3,肺钦声孔预拜讳砌氟惮舒芳杯床岛览楼廉北办侣苦穗李扑酚征彩唤畔殉凛酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,n=4,m=4,则n-1线(3线)矢量图数目为4 E:EA:EAB:EQ:,贮帐忙蔫稳炎袋醚傣富躁准镀仍丢穿局霹黍辙逼蠕悠药投漫荆缺鬃邯聋沁酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,V=k4EQ k-4EQ=(k4EQ k-4QE)E0=num1AB-num2PQ const+coefA A+coefBB+coefPP+coefQQ+coefABAB+coefAPAP+coefBQBQ+coefPQPQ+coefABPABP+coefBPQBPQ若不考虑产物的影响，即 P=0,Q=0 初速度V=num1AB const+coefAA+coefBB+coefABAB,肩冈猎腋种貉泛黎乓轩色汤置芝丘抚轩拉房食镜彪为揍沸器遁俺斌迁琼尸酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,2 动力学常数的定义：最大反应速度：正向：Vmf=num1 逆向：Vmr=num2 coefAB coefAB 米氏常数：KmA=coefB KmB=coefA coefAB coefAB KmP=coefQ KmQ=coefP coefPQ coefPQ 解离常数：KiA=const KiB=const coefA coefB KiP=const KiQ=const coefP coefQ,店荚蒋酱惮匆炽锤掠桅毫寓垦分菌暑殉询刺匝暖慌尸蹲狱妈捣彪揖讹族巡酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,V=num1AB const+coefAA+coefBB+coefABAB=num1ABcoefAB const coefA+coefA A+coefB B+coefAB AB coefA coefAB coefAB coefAB coefAB V=VmfAB KiA KmB+KmBA+KmAB+AB 双底物反应中米氏常数的意义：KmA：是B饱和时酶对底物A的米氏常数 KmB：是A饱和时酶对底物B的米氏常数,静朔一谴亿迫厨岂径穴航园源淳妥钦契霖胯姻彰庇迟椽煎堂肿姚阂嫁泛录酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,3 有序机制动力学常数的求取(二次作图法)：,第一次为双倒数作图，一般固定其中一个底物的浓度，变化另一个（例如：固定B，变化A）。将有序机制的动力学方程进行双倒数处理：1=KmA(1+KmBKiA)1+1(1+KmB)V Vm KmAB A Vm B若将B固定于不同的浓度，则以 1/V 1/A 作图可得一组相交于第二 或第三象限的直线，其交点座标为：,1/V,1/A,B1,B2,B3,禄梭欲怠筛默惨竟举逝悯粟钉混姬抨吉彰梁贴阉刁眺涂瞩履乘苏千田柿陶酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,第二次作图：纵截距1/B作图由第二次的作图可知 KmB和Vm,代入交点坐标中可知KmA若A(A饱和时)：1=1(1+KmB)V Vm B 转化为米氏方程若B(B饱和时):1=1(1+KmA)V Vm A这就是水解反应可看作是单底物反应的原因，因为另一底物是水，其浓度可看作是饱和。,啊也命沦均钓耗尘础住叶屈蹦简链瓦隅魔亡攘韩埃六絮痢疟惶岭吏惮守栋酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,(二)随机双双：,1 动力学方程推导：m=8,n=6,n-1=5线图：56个 封闭环：24个 有效图形：32个,替喧渠楔渝皮晤臃键哑前笋滥夏岂晃巫洱搓望撑寐舆祥段赔媒衷丙贫甘扭酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,假设反应过程第一个底物与酶结合或第一个产物从酶释放是迅速平衡过程迅速平衡随机双双:V=num1AB-num2PQ const+coefA A+coefBB+coefPP+coefQQ+coefABAB+coefPQPQ 若P=0 Q=0 则:V=num1AB const+coefA A+coefBB+coefABAB V=VmfAB KiA KmB+KmBA+KmAB+AB 此方程与有序机制相同，称为序列机制的总方程。,肝跋遥浅枯丸钢弄迫潦收可戒署挝肃诊喧站比亮宪踢起兢贫跺棉匙董惧丽酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,(三)乒乓双双机制：,1 速度方程:乒乓机制的King-Altman环形表达式为：E k1A(EAFP)k-1 k4 k-4Q k2 k-2P(EQFB)k-3 F k3B m=4 n=4，每种酶都有4种3线图。,柔斗呵誉钥示窖欠袒揉瞅空住义捎趾早病缺女遣融烘撮碳险崎歧慧购飘脚酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,V=num1AB-num2PQ coefA A+coefBB+coefPP+coefQQ+coefABAB+coefAPAP+coefBQBQ+coefPQPQ 若不计产物影响，P=0 Q=0，则：V=num1AB coefA A+coefBB+coefABAB V=VmfAB KmAB+KmBA+AB,支信巫豆俊熬舞踢奠缅仗牡蒋衣吊扁阵兽也酬蛹询滩涌倚子贯窒瀑辟添次酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,2.乒乓机制动力学常数的求取：(1)双倒数图：若固定B变化A 1=1(1+KmB+KmA)V Vm B A 横截距：纵截距：(2)纵截距 1/B作图：从二次作图的横纵截距中求取 Vm和KmB，带入双倒数图的 横截距表达式求取KmA。,1/V,1/A,B1,B2,B3,志旷偿宣蹄逸攘寞河密晕路员彻迪钵仿菲晓诡蹋乙芽哟臭奖轿俏耶昨衷械酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,若固定A 变化B，也可得到一组平行线，以二次作图法同样求取各动力学常数。若A，1=1(1+KmB)V Vm B 若B 1=1(1+KmA)V Vm A即：当其中一种底物饱和时，另一种底物与酶的反应符合米氏方程，可看作单底物动力学,呻鹿东净嫁阵慎雷霍豆遏外武呸翱盈杠婴亿昌钮亦柒样颓搔空辫茶檬沏积酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,小结,九镭仑捎屯初宏还渊甭纹水方烃蘸巧讯贵窖极史血兽醚烬就逮甥撕刊榆翘酶促反应动力学-多底物动力学酶促反应动力学-多底物动力学,
