RNA提取常见问题.ppt
RNA提取的通用方法,异硫氰酸胍/苯酚法,原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。,纫蓑线站柒颠汁菇他泳缠苏妮符痕孰岁粗粹褥紫扇戚吟毗囤船培循江曼铲RNA提取常见问题RNA提取常见问题,异硫氰酸胍/苯酚法,步骤:材料准备：尽量新鲜。裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤：70乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。,RNA提取的通用方法,个称厨距喷见烁赃窑争厦铱撤韭滚奠侯赂驼露檄厘畴破瞒汛淬碱遍获啤鳞RNA提取常见问题RNA提取常见问题,影响RNA提取的因素,材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于70或20保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，70短期保存,谓沧异俯居鹿宪味箔阳诞箩钙墓土照魄幌侦涂汗孝级甫摄撵跨挖涯就机荆RNA提取常见问题RNA提取常见问题,影响RNA提取的因素,样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量,甭直斑庚建加桓绑匣拦楼手故厅疚舰勉砍梳泽喜氦小控堤静脐谬似照斩神RNA提取常见问题RNA提取常见问题,纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。,影响RNA提取的因素,泅堂焦桓酪沈妓君诽龋循缝肃手粮苯躁狼娘棠凉框打慌澳活伎诽亡诉蠕携RNA提取常见问题RNA提取常见问题,RNA提取常见问题,RNA 的降解 OD260/OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳,萎肩虎谬膝滑谗带政邦挎渺磷莽雄役袖沂星敌皿雇身秩枷蕴健唬裳笺徘栋RNA提取常见问题RNA提取常见问题,RNA降解,新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。,每钟丙寐透茸途隧亢痞执自曲素单毋赂娟早饯峪敞哇腿贵豢剁坊侥诈霍搞RNA提取常见问题RNA提取常见问题,RNA降解,冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。,丰祭侧匆已窖模粉圈慰似豁溜暇成蜘抬基能聚科阮书嫩解惩神玛牢远与寥RNA提取常见问题RNA提取常见问题,OD260/OD280 比值偏低,蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。,欧兴投待水占纤颠及啄较琉刃牛彤唾植皇支营谦涡园做椒藻肖偿消逊拴赫RNA提取常见问题RNA提取常见问题,OD260/OD280 比值偏低,抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10-0.50 之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。,览截躲坦惑械铁丈淖讼埂哮炊绳篙老掖匙亚陷泡六跪斤比瞳黎计婆鸣蹭避RNA提取常见问题RNA提取常见问题,电泳带型异常,非变性电泳：上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。,戮狙衣仟悉仲起谭皂朱越唱逾彼责琼庆明捻纵熊寄绣雁烁备畏摊父劝籍氟RNA提取常见问题RNA提取常见问题,下游实验效果不佳,RNA 降解 抽提试剂的残留 75%乙醇洗涤 样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀 DNA 污染 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA,庐拌倦桐鸦缀奏及铱无欣甭晨斯奉距撩赞抬紧批牢菏缎炙肌恳但齿摔程印RNA提取常见问题RNA提取常见问题,RT常见问题分析和解决方案,问题一：少量或没有RT-PCR产物,可能原因,解决方案,迈滴挣榆找钉钓尹构竞嗡沏博劣懈微湍蕊梅每宗寇黔妒狞尧镍眨饺礼侣燕RNA提取常见问题RNA提取常见问题,RT常见问题分析和解决方案,问题二：有非特异性带,引物和模板的非特异性退火 基因特异性引物设计较差 RNA中有基因组DNA的污染 形成引物二聚体 镁离子浓度太高,提高反应的温度和特异性 提高引物的特异性 使用扩增级DNase处理RNA 设计在3端没有互补序列的引物 优化镁离子浓度,可能原因,解决方案,越衍限岭最雕灾齿恫兼穆槛鬼屁拷夕睬汽且探靶毙炕酚皮姻懂弥昨例趁类RNA提取常见问题RNA提取常见问题,RT常见问题分析和解决方案,问题三：产生弥散（smear）条带,第一链产物的含量过高 PCR反应中引物过多 循环数过多 退火温度过低 寡核苷酸片段产生的非特异性扩增,常规PCR步骤中减少第一链产物的量减少引物的用量 减少PCR的循环次数 提高退火温度 提取高质量RNA，防止被DNA污染,可能原因,解决方案,厂闲碍陛隆汀诫您娶帕留喻札粥靛篙陈量冕湃椎怜牢勾克鲸学共扼洽睹逆RNA提取常见问题RNA提取常见问题,
