双向电泳蛋白样品的制备.ppt
双向电泳样本制备,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,一、蛋白质提取原则：二、样本裂解方式：三、2D蛋白裂解液组成及作用：1：裂解液组成及作用 2：常见裂解液四、蛋白质提取步骤：五、蛋白质样本制备实例：1：动物组织样本制备 2：植物组织样本制备六、样本制备试剂：,双向电泳样品制备：,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,1:蛋白质制备主要目的：(1)：细胞，组织的破碎裂解(2)：蛋白质溶解以及破坏蛋白质与蛋白质分子之间，蛋白质与 非蛋白质之间的共价与非共价相互作用,2:蛋白质制备主要遵循的原则：(1)：尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的共价结合，使 蛋白质以分离的多肽形式存在。(2)：避免蛋白质的修饰作用与蛋白质的降解作用。(3)：避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用。(4):去除高丰度蛋白对低分度蛋白的掩盖作用。(5):防止样品在聚焦时发生蛋白质的聚集和沉淀。(6)：蛋白质样品与第一向电泳的相容性。,一、双向电泳样本制备原则,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,二、双向电泳样本裂解方式温和裂解方式,二、双向电泳样本裂解方式剧烈裂解方式,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,1、变性剂：(1)作用：改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质的肽链伸展 开来，充分暴露疏水中心。(2)分类：脲，硫脲，或两者的混合物可以增加蛋白质的溶解性，特 别是膜蛋白。必须避免将含有尿素的溶液加热到30度以上，因为这样会使其水解为氰酸盐，修饰蛋白质，改变蛋白质的 电荷。,三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,2、去垢剂：(1)作用：破坏蛋白质分子间的疏水相互作用。(2)种类：a:非离子去垢剂：triton X-100,NP-40 b:两性离子去垢剂：CHAPS,CHAPSO SB3-10(不溶于浓度高于5mol/L的脲中）ASB(具有比CHAPS更强的膜蛋白溶解力）c:阴离子去垢剂：SDS（小于0.25%，同时确保其他去垢剂与SDS的比例至少为8：1）,三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,3、还原剂：(1)作用：断裂蛋白质中的二硫键，以利于肽链的分离。(2)分类:-巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）,二硫赤藓糖（DTE）a:其中DTT带有电荷，在等点聚焦时，常常会迁移到PH范围 以外，从而使某些蛋白质的二硫键重新配对，使溶解度降低而重新沉淀下来。使用浓度范围10100 mmol/L.b:采用非离子还原剂三丁基膦TBP可以大大增加蛋白质的溶解性，并利于蛋白从第一向转移到第二向。但是TBP在水溶液中的不稳定性和不溶性，使其在第一向IEF中维持蛋白质还原状态是相对无效的。因此在IEF时建议最好使用巯基还原剂。,三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,4、蛋白酶抑制剂的种类及作用：,三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,1、提取前准备：（1）:提取总蛋白，亚细胞蛋白；（2）:裂解细胞的方式选择；（3）:裂解液的选择。2、加入裂解液，冰上放置一段时间。3、离心去沉淀，收集上清蛋白。4、用于二维电泳时，考虑是否有必要除去干扰物质，如核酸，脂类，盐等。,三、双向电泳样本制备简要实验步骤,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,五、双向电泳样本制备实例动物样本,（1）将组织切细后置于研钵中，迅速加入液氮进行研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒即可。（2）在研钵中加入800LB（使用前加入1 PMSF），充分溶解（收集）粉末后转移至1.5mLEP管中，4，12000r/min，离心20min，收集上清液。（3）超声处理，破碎核酸。每个EP管超声3次，每次58下，然后进行离心，4，12000r/min，离心20min，收集上清液。（4）将上清液分装成3管，每管约250L，每管再加入1mL丙酮-20沉淀过夜。沉淀完的蛋白质于4，12000r/min，离心20min，倒去上清液后，平放于干净的纸巾上自然干燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80保存备用。(5)在干燥后的蛋白质团块中加入相应量的RB（具体加入量视蛋白团块大小而定），用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质完全溶解。对于太过干燥的蛋白质团块（呈透明状），可用50L移液器调至10L刻度处，吸上一点RB封住枪头，然后反复的将蛋白质团块戳小，再用超声仪处理，直至看不到明显的蛋白质团块为止。4，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中。,五、双向电泳样本制备实例植物样本,（1）植物样本置于研钵中，迅速加入液氮进行研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒即可，在研钵中加入一小勺PVPP（用于吸附植物组织破碎后释放出的酚类物质），用药勺将粉末转移至50mL离心管中。（2）在50mL离心管中加入8mL提取液混匀，再加入8mLTris饱和酚，充分振荡后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，45000r/min，离30min，此时溶液会分层，下层为水相，上层为酚相，吸出上层液体，转移到15mL离心管中。（3）加入与酚相同体积的提取液，充分振荡后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，4，5000r/min，离心30min，吸出上层酚相，转移至新的15mL离心管中。重复一次苯酚抽提。（4）加入最后得到的酚的5倍体积的醋酸铵甲醇溶液对蛋白进行沉淀，充分振荡后置于冰上保温每隔5min振荡一次，总共6次，于-20沉淀过夜。（5）对沉淀过夜的蛋白质4，5000r/min，离心30min，倒掉上清液，加入5mL甲醇对蛋白进行洗涤，反复吹打均匀后，4，5000r/min，离心30min。重复一次。,五、双向电泳样本制备实例：,（6）加入4mL丙酮对蛋白进行洗涤，反复吹打均匀后，4，5000r/min，离心30min。重复一次操作。加入3mL丙酮，吹打均匀后将蛋白质平均分到3支1.5mLEP管中，4，12000r/min，离心20min。倒去上清液后，平放于干净的纸巾上自然干燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80保存备用。(7)在干燥后的蛋白质团块中加入相应量的RB（具体加入量视蛋白团块大小而定），用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质完全溶解。对于太过干燥的蛋白质团块（呈透明状），可用50L移液器调至10L刻度处，吸上一点RB封住枪头，然后反复的将蛋白质团块戳小，再用超声仪处理，直至看不到明显的蛋白质团块为止。4，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中。,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,六、双向电泳样本制备试剂,Alklysis buffer(LB),Phenol extraction buffer,醋酸铵甲醇溶液Ammonium acetate in methanol,用甲醇配制0.1M的醋酸铵,辉骏生物：http:/免费服务热线：400-699-1663,THANKS!,
