《癌肿瘤遗传学》PPT课件.ppt

1,Cancer Molecular Genetics,China Medical University Department of Medical Genetics Li fucai 2005.10,2,Cancer（Tumor）Molecular Genetics,一、癌分子遗传学概述 二、癌发生的遗传因素 三、癌的染色体异常 四、癌发生的基因控制 五、癌的多阶段演化 六、端粒和端粒酶,3,一、癌分子遗传学概述1、概念 每一个正常细胞中有一种特殊的排列可以抑制细胞分裂，假定存在一些抑制分裂的染色体，它的丢失将引起肿瘤细胞的无限生长，另一方面，假定还存在促进分裂的染色体，当受到某种刺激激活时，细胞就发生分裂，由此可推断恶性肿瘤细胞的快速无限增殖的趋势，是由于促进分裂的染色体的持久优势所致。Theodor Boveri，1911,4,至今，大量的科学证据表明：促进细胞生长的染色体-癌基因 抑制细胞生长的染色体-肿瘤抑制基因,5,自1990年起人们把癌/肿瘤称为体细胞遗传病。它是具有遗传基础的。肿瘤遗传基础的证据最初来自于三方面：第一 DNA突变引起癌的发生；第二 肿瘤常常出现特异性染色体异常；第三 在罕见的肿瘤特异性综合征中，肿瘤发 生、发展的遗传易感性。,6,如何揭示肿瘤发生的遗传机制呢？遗传学家与临床肿瘤学家们从（群体、细胞、生化、免疫）遗传学和分子遗传学不同角度探讨肿瘤与遗传的关系，就逐渐形成了一门新学科癌分子遗传学。简言之，就是应用遗传学的基本原理、方法研究肿瘤的发生、发展与遗传的关系及规律，揭示肿瘤发生机理。,7,2、癌与肿瘤的概念 单细胞生物为了生长，必须对环境的变化产生反应，细胞为了营养的来源和生长、分裂，与周围的细胞竞争，直至营养供应被耗尽。进化创造了多细胞生物多细胞机体，高等生物。,8,从受精卵开始 多细胞机体（繁殖后代）多细胞共同协作（信号传导机制进化了，细 胞生长、分化，得以协调，执行生物学功能）如果一个细胞或若干细胞发生突变（该细胞竞争空间和营养，扰乱了细胞分裂和细胞协作）某些细胞形成克隆肿瘤（Tumor，良 性）。就形成癌（Cancer，恶性）,9,通常在文献中见到：,Tumor：泛指肿瘤（包括良性、恶性）肿物。Cancer：恶性肿瘤的总称，癌肿。Sarcoma：源于间叶组织（肌肉、骨、软骨、纤维）的恶性肿瘤，如骨肉瘤、纤维肉瘤。Carcinoma：来源于上皮的恶性肿瘤癌。来源于鳞状上皮鳞癌。来源于腺上皮 腺癌。例如：胃粘膜上皮恶变胃癌。另外：肝癌、皮肤癌、肠癌等。,10,良、恶性肿瘤的基本区别：肿瘤是由连续无休止生长，且分化差的细胞组成，一般有良、恶性之分。1）良性肿瘤的特征（异形性与周围组织差异不显著）;2)细胞被周围正常组织所局限，常有一层纤维结缔组织包围；3）生长缓慢，呈膨胀性，对周围组织不具侵袭破坏性,不发生远处转移。,11,12,1）恶性肿瘤的特征（异形性与周围组织相差大、显著）,a）细胞呈侵润性生长，周围无结缔组 织包围；b）生长速度快，侵袭和 破坏周围正常 组织；向远处转移和播散，c)形成 继发性肿瘤。,13,14,细胞水平看：,l组织培养中的正常细胞需要外源性生长因子，使得细胞得以增殖。它们具有明显的接触抑制，所以，一旦细胞生长成单形层，增殖停止。与此相反，培养的癌细胞有一些或全部下列的特征：1）减少对生长因子的需求。2）丧失接触抑制，所以细胞倾向于堆积和形成集落（病灶）3）具有无限期分裂的能力，既细胞永生化4）不依赖锚定生长，具在软琼脂中生长的能力。,15,NORMAL CELL AND CANCER CELL,16,上述我们提到肿瘤或癌形成的前提是细胞突变：生殖细胞突变：生殖细胞突变遗传给后代，在后代机体中成为肿瘤发生的始祖细胞，累及机体的某一部分。体细胞突变：突变的细胞具有增殖优势，而形成实质性的细胞克隆。,17,体细胞突变,生殖细胞突变,18,总之，突变影响整个Gene组的稳定性，使细胞增殖优势-形成肿瘤。,3、癌发生的环境因素,所有生物生存于自然界中和环境有着千丝万缕的联系，密不可分，人们所处的环境之中有：,19,Uv 过量 物理因素 电离辐射 白血病、皮肤病等。如：血疑 日本长崎、广岛 前苏联契尔诺贝利核电站核泄漏。多环芳烃化合物（如 3，4苯并芘）化学因素 肺癌 黄曲霉素 肝癌 亚硝胺 各种消化道肿瘤生物因素 某些病毒（DNA、RNA）动物 肿瘤。某些人类肿瘤（鼻咽癌、宫颈癌、白血病）,20,21,22,23,然而，尽管人们都接触各种致癌因子，并不一定都发生肿瘤，这表明，肿瘤的发生是环境因素和遗传因素共同决定的。引用一个哲学观点，“外因是变化的条件，内因是变化的根椐，外因通过内因而起作用”。环境因素只有改变遗传物质(DNA/RNA)的结构或功能才能使正常细胞转变为癌细胞。对于不同的个体/不同的肿瘤，环境因素与遗传因素对其作用的大小各异。,24,二、肿瘤发生中的遗传因素,许多事实都说明遗传因素在肿瘤发生中的作用如：1、肿瘤的家族聚集现象 癌家族（Cancer family）是指一个家系中恶性肿瘤的发病率高，发病年龄较早，肿瘤按常染色体显性方式遗传。典型的癌家族G家族：历经80余年（18951976），5次调查，传7代共10个支系，842名后裔中分析，符合常染色体显性遗传特点：I、双亲之一是患者；II、同胞中1/2发病，男女发病几率均等；III、连续传递；、双亲无病后代则不发病。,25,典型的癌家族G家族,26,家族性癌（familial carcinoma）,是指一个家族内多个成员患同一类型的肿瘤。这类癌的遗传方式虽然还不清楚，但表明有家族聚集现象。这种家族集聚现象提示，遗传因素在肿瘤发生中的作用。,27,2、肿瘤发病率的种族差异,不同种族中某些肿瘤发病率有明显差。如：鼻咽癌：中国人：马来人：印度 发病率：13.3:3:0.4（居住在新加坡）移居到美国的华人比美国人高34倍。黑人易患Ewing 骨瘤、睾丸癌、皮肤癌。日本妇女乳腺癌比白人少，但松果体瘤却比其它民族高10倍。提示：不同种族的差异主要是遗传差异，这种差异在肿瘤发生种起作用遗传因素的作用。,28,3、遗传性肿瘤,某些肿瘤是按孟德尔方式遗传的，亦即单基因的异常决定的，它们通常以常染色体显性遗传方式传递，常为双侧性，多发性，发病早于散发型，具有不同程度的恶变倾向。如：,29,家族性结肠息肉（FPC）,患者表现为青少年时结肠和直肠有多发性息肉，继发性恶变，90%未经治疗的患者死于结肠癌。该病称为遗传性癌前病变。FPC Gene定位于5q21（癌基因突变）。,30,I 型神经纤维瘤（NF1）,患者沿躯干的外周神经有多发的神经纤维瘤，皮肤上可见多个浅棕色的牛奶咖啡斑，腋窝有广泛的雀斑，（少数）患者有恶变倾向性。NFI发生与NF1肿瘤抑制基因密切相关，NF1 Gene 定位于17q11.2（NF1 Gene 突变/缺失）。此外，基底细胞痣综合征，恶性黑色素瘤等也属于遗传性肿瘤。还有一些肿瘤既有遗传性的也有散发的。如：,31,视网膜母细胞瘤眼球、视网膜的恶性肿瘤，随血液循环转移，侵入颅内引起死亡。,遗传型 散发型显性遗传 生殖C 突变 散发（两次 体C 突变 体C突变）发病年龄早（2岁前就诊）发病晚双侧、多瘤 单侧、单瘤 40%60%,32,神经母细胞瘤,常见于儿童的恶性胚胎瘤，起源 于神经脊，并发N纤维瘤、N节瘤、嗜铬细胞瘤等。遗传型 散发型 AD 散发 发病早 发病晚 20%80%,33,Wilms tumor,是一种婴幼儿肾脏的恶性胚胎瘤。遗传型 散发型 AD 散发 发病早 发病晚 双侧 多为单侧 38%62%11p12-11p15-,34,如何解释同一种肿瘤既有遗传型的又 有散发型，而且发病年龄不同哪？,早在1971年，Knudson 以研究视网膜母细胞瘤的发生为基础，提出二次打击假说（二次突变学说）。恶性肿瘤的发生涉及二次以上的突变，在遗传型的恶性肿瘤中，遗传的是一次生殖细胞的突变，在此基础上再发生一次体细胞突变即可完成始动，从正常细胞转化为恶性细胞。恶性细胞在一定条件下形成增殖优势，既可建立恶性细胞克隆而形成肿瘤。在散发的恶性肿瘤中，二次突变都是体细胞突变，而且同时发生在一个细胞中才能完成始动。这种机会很少，需要漫长过程的积累，所以散发型肿瘤多为单侧发病，发病年龄晚。,35,4、染色体不稳定综合征,染色体是遗传物质（gene）的载体。某些隐性遗传病患者有全身性染色体容易断裂或对紫外线特别敏感的特点，这表明肿瘤与染色体不稳定性之间有某种联系，这一类疾病称为染色体不稳定综合征。例 如：,36,疾病 染色体异常 易患肿瘤 Fanconi 贫血 单体断裂、裂隙、儿童期的骨髓疾 双着丝粒、病表现为全 染色体自发断裂 血细胞减少 增高 转变为白血病 又称先天性全 血细胞减少 Bloom 综合征 四射体、SCE 比 易患肿瘤、患者身材矮小，正常人高10倍、或白血病 对日光敏感,各种类型染色体 面部血管扩张性 畸变 红斑,37,毛细血管扩张性 染色体断裂、14/14 Ly细胞白血病共济失调 表现小脑 易位、DNA 修复能力 淋巴瘤、网性共济失调 下降 织细胞瘤等着色性干皮病 染色体自发断裂 血管瘤、基底（xp）对Uv DNA修复酶缺乏 细胞癌等肿瘤敏感、皮疹、色素沉着,疾病 染色体异常 易患肿瘤,38,三、肿瘤的染色体异常,肿瘤细胞遗传学研究表明：几乎所有肿瘤细胞都有染色体异常，因之染色体异常被认为是癌细胞的特征，也说明了肿瘤与遗传的关系。1、基本概念 克隆演化：研究表明，大多数肿瘤都有染色体异常，同一种肿瘤细胞的染色体常发生有许多共同的异常表现，它们都来源于一个共同的突变细胞，这可以 用肿瘤发生的单克隆学说来解释。,39,单克隆学说,基因突变,癌蛋白,40,肿瘤单克隆起源证据：,体细胞突变和克隆选择模式判定，肿瘤在组成上是单克隆。在女性X连锁基因分析提供了首要证据。如:胚胎发育早期，X染色体随机失活，女性就细 胞的组成上具有两种不同的X染色体的嵌合体。46，XAXa XAXa XA Xa,41,例如：G6PD（葡萄糖6磷酸酶）位于X染色体上的基因。,野生型在一条染色体上（XA）杂合子个体 突变型在另一条染色上（Xa）根据G6PD 活性，应用细胞化学染色方法检测，杂合个体（正常组织）有活性与无活性的嵌合体，肿瘤组织中是单一形式，既阳性/阴性。,42,正常组织 肿瘤组织,XA Xa,XA失活,Xa失活,43,例 如:,子宫纤维肌瘤（一种常见的良性子宫平滑肌瘤）研究表明，在G-6-P-D杂合子女性中，每一个子宫纤维肌瘤仅表达A型或a型的G-6-P-D，从不同时表达两种，提示每个肿瘤可能起源于单个细胞。,44,但是，癌细胞群体受内外环境的影响而处于不断的变异之中，这就决定了各癌细胞核型的多样性。其结果，同一肿瘤各个细胞的核型常常不完全相同，不仅如此，不同核型的细胞生存、繁殖能力不同，有的在选择过程中逐渐被淘汰，有的则形成增殖优势，因此，细胞群体处于选择之中。这种类似物种进化的过程，称为克隆演化（clone evolution）。,45,、干系（stem）和众数（modal number）,在一个肿瘤的细胞群体中，占主导地位的克隆，就构成干系。干系的染色体数目称众数。干系以外有时还存在一些非主导地位的克隆，称为旁系（side line）条件改变 干系 旁系,46,2、肿瘤染色体数目异常（Tumor chromosome number aberration）,肿瘤细胞染色体大多数为非整倍体，例如：亚二倍体46，超二倍体46亚三倍体69，超三倍体69高异倍体亚四倍体92，超四倍体92 在培养的肿瘤细胞、实体瘤、癌性腹水中常见。,47,3、染色体数目异常产生的机制,基因突变-p 53基因扩增-EGFR基因过表达STK15STK15 Gene 中心体异常 纺锤体异常 染色体分离异常 细胞分裂异常 基因组不稳定 肿瘤发生。,48,正常细胞分裂,49,细胞有丝分裂的荧光显微图像,有丝分裂1 有丝分裂2,50,细胞有丝分裂,51,染色体异常产生机制,52,4、肿瘤染色体结构异常（Tumor chromosome structure aberration）,结构异常是由于染色体断裂重接，形成特殊结构的染色体，称为标记染（marker chromosome）：非特异：只见于某种肿瘤的少数肿瘤细胞 中，对该肿瘤不具有代表性 特 异：经常见于某种肿瘤的大多数或全部 细胞，对该肿瘤具有代表性，并以 其为特征。特异性标记染色体的存在，支持了肿瘤起源一个突变细胞的设想。,53,重要的特异性标记染色体,ph染色体 Nowell和hungerford 首先在美国费城（phliadelphia）发现，因而命名ph 染色体。Ph 染色体是一个小于G组的近端着丝粒染色体，是22号染色体长臂缺失形成的，缺失的部分易位至9号染色体长臂末端，是一种相互易位。,54,Karyotype,55,t（9；22）（q34；q11）,56,ph染色体临床意义：,A、作为慢性粒细胞白血病（CML）诊断依据，约95%CML患者具有ph染色体；B、用于区别ph阴性白血病，临床症状相似，但ph阴性CML患者对治疗反应差，预后不佳。C、用于早期诊断，有时ph染色体先于临床症状出现。,57,14q+染色体,90%的 Burkitt淋巴瘤病例中可看到一条长臂增长的14号染色体，既14q+是相互易位结果。t（8；14）（q24；q32）,58,脑膜瘤 del（22q）视网膜母细胞瘤 del（13q14）Wilm瘤 del（11p13-14）小细胞肺癌 del（3p14-23）神经母细胞瘤 del（1p34-p ter）,此外，还有：,59,5、染色体异常在肿瘤发生中的作用,早在1914年，德国学者Boveri，就提出肿瘤的染色体不平衡学说，认为染色体异常是肿瘤发生的原因。的确癌细胞大多数都有染色体异常。然而，肿瘤的染色体畸变非常复杂和多样化，并非每种肿瘤都有特异性的染色体改变，这些事实似乎又不支持上述学说。近年来，对肿瘤染色体的大规模的研究、统计学分析发现，多数肿瘤染色体虽然没有高度特异性的标记染色体，但它们的染色体改变并非都是杂乱无章的，有一定规律可循。如：,60,1)某些肿瘤经常有某几条染色体参与畸变，这种现象称为肿瘤染色体的非随 机性或集聚（集中于某些染色体）。例如：慢性粒细胞白血病,集中在染色体 8、9、17、22 急性粒细胞白血病，集中在染色体 7、8、17、212)而且染色体断裂部位也非属偶然 这都表明肿瘤染色体异常仍有一定规律性，因之在细胞癌变过程中有着某种意义。,61,：,原发性异常是致癌因子作用于遗传物质的直接结果，表现为基因突变或染色体畸变是非随机的，有时甚至是高度特异性的。如：CML的ph染色体；Burkitt淋巴瘤14q+。继发性异常是癌变过程中细胞分裂、增殖过程紊乱的结果，是随机的，因而，染色体多种多样，这可以解释肿瘤染色体异常的多样性。由于克隆演化，具有某些染色体组合的细胞具有选择优势得以增殖。继发性异常的意义在于扩大原发性效应的作用。,一些学者提出应区别两类染色体畸变,62,一般认为染色体畸变不是肿瘤发生的始动因素，而是致癌因作用的结果。但它可能是细胞癌变过程中的重要环节，有助于肿瘤发生过程中的某些重要过程的进行，如某些癌基因激活、扩增、过表达，抑癌基因的缺失或失活，从而导致细胞转化和癌变。,总之,63,6、瘤发生的遗传易感性,上述列举的许多事实都说明肿瘤发生的遗传因素。因此，肿瘤可以认为是基因染色体遗传引起的疾病。其中一些遗传性肿瘤按照经典的孟德尔方式传递，但在更多情况下人类遗传的只是对肿瘤的易感性，并非亲代把肿瘤直接传给子代，遗传的只是单个基因，它在肿瘤发生上起了重要作用，即易感基因。个体在易感状态下如再发生体细胞突变，突变的细胞容易转化为肿瘤细胞。,64,肿瘤遗传易感性,个体的肿瘤遗传易感性是由特定的基因染色体组合决定的。虽然对这些易感基因及其如何发挥作用的了解还不很清楚，但有 一些事实表明它们可通过生化、免疫和细胞分裂的机制促进肿瘤发生。例 如：,65,1)肿瘤遗传易感性,Gene 芳烃羟化酶（AHH）代谢物 多环芳烃 致癌（如肺癌等）gene DNA修复酶 DNA复制 细胞突变（如；XP皮肤癌）复制差错,66,2)遗传性免疫缺陷,抵御抗原的侵入正常免疫监视系统 排斥异己细胞（突变C）缺陷突变细胞逃避监视 增殖、转化、恶变（如：无丙种球蛋白病-易患白血病、淋巴系统肿瘤）。,67,3)染色体病,21-三体（Down syndrom）易患急性白血病，高1520倍.Klinefelter 综合征男性乳癌。精原细胞瘤，两性畸形患者 性母细胞瘤。,68,四、肿瘤发生的Gene控制,个体发育后，机体的细胞处于动态平衡之.,69,Cell Cyclo and Checkpoint,G0期死亡 被动-免疫系统、吞噬 主动-C凋亡 不再增殖的C-角质C、神经C、RBC G1期 暂不增殖的C-肝细胞、肾C 继续增殖的C-骨髓C、消化道上皮C,Checkpoint,S期,Checkpoint,Checkpoint,G2期,M期,70,71,Checkpoint,控制点/检控点：G1/S期、S期、G2/M期、纺锤体。重要Gene+产物 细胞周期调控。有多种基因及某些Gene产物参与Checkpoint，调节C增殖。换言之，肿瘤发生 涉及多种Gene参与。如癌Gene、肿瘤抑制Gene、增变Gene、肿瘤转移Gene及转移抑制Gene。,72,1、癌基因（Oncogene）,1）癌基因发现 癌基因（Oncogene）：存在于致癌病毒、人和动物细胞中能导致细胞恶性转化的核酸片段，促进细胞的生长和增殖。癌基因，是生长因子刺激激活细胞分裂途径的主要元件（成分），突变结果使其活性增加，使得细胞恶性转化。现已发现100多种 癌基因，如何发现的呢？,73,早在1910年，Rous的研究拉开了癌Gene研究的序幕,接 种 鸡肉瘤 无细胞提取物 鸡 肉瘤 发现了Rous肉瘤病毒（RSV），是RNA（gene 组）逆转录病毒。然而，历经 半个世纪几乎无进展。,74,Dulbco研究,1963年，Dulbco研究发现正常细胞感染病毒可恶变为癌.感 染 病毒 细胞 癌细胞1969年，Huebner等，提出病毒基因致癌假说，推论在正常细胞中含有与逆转录病毒同源的DNA 序列-癌基因。,75,Martin和Vogt证实,1970年Martin，和Vogt1971年证实，RSV基因组内含有诱导肿瘤产生的基因-病毒癌基因，并命名为Src基因，写成V-src。,76,肿瘤 病毒分为三类：,DNA病毒：感染细胞后病毒Gene组整合到宿主细胞Gene组.如腺病毒EIA、EIB和SV40病毒。逆转录病毒（retrovirus）：RNA gene组，逆转录酶介导DNA复制，含有三个基因：,77,逆转录病毒（retrovirus）,gag pol env 核心蛋白 逆转录酶 外壳蛋白,78,急性转化逆病毒:,病毒颗粒转化宿主细胞快速、高效，基因组含有附加的癌基因。1976年，Bishop等，在鸡正常细胞中发现有与 V-src基因同原的细胞癌基因，写成C-src。首次在正常细胞中发现具有转化潜能的基因-细胞癌基因。此后，相继在其它动物C中也发现有癌Gene。,79,体外转染（transfaction）,体外转染（transfaction）实验证实，癌细胞含有激活的癌基因。提取人膀胱癌细胞系（EJ cell line）DNA 片段 转 染 小鼠细胞（NIH3T3）（小鼠成纤维细胞）恶性转化细胞Weinberg等转染实验证实，转染后的 NIH3T3中含有人膀胱癌的癌基因，并称为H-ras,80,体外转染（transfaction）实验,81,2）癌基因的功能分类,按原癌基因的产物将100多种癌基因分为五大类以Src为代表的 酪氨酸激酶类（ras,abl），信号传导以sis为代表的 生长因子类以erb为代表的 生长因子受体类以myc为代表的 核蛋白类和转录因子以PRAD1为代表的 细胞周期素、CDK 网络成分和激酶 抑制因子类,82,癌基因的功能分类,83,Oncogene Location Function Nuclear transcription regulators jun Nucleus Transcription factor fos Nucleus Transcription factor erbA Nucleus Member of steroid receptor familyIntracellular signal transducers abl Cytoplasm Protein tyrosine kinase raf Cytoplasm Protein serine kinase gsp Cytoplasm G-protein subunit ras Cytoplasm GTP/GDP-binding proteinMitogen Sis Extracellular Secreted growth factorMitogen receptors erbB Transmembrane Receptor tyrosine kinase fmsT ransmembrane Receptor tyrosine kinaseApoptosis inhibitor Bcl2 Cytoplasm Upstream inhibitor of caspase cascade,84,3）原癌基因激活机制,在正常细胞中存在着与癌基因极为相似，具有转化潜能的一类基因，称为原癌基因(proto-oncogene)。原癌基因在个体发育或细胞分裂的一定阶段十分重要，在成体或平时不表达，或者表达受到严格的控制，当其发生突变或被异常激活时，产生的癌蛋白在性质或数量上区别于正常细胞，就可能导致细胞发生恶性转化。,85,原癌基因 质的变化：突变，重排，产 生新的嵌合基因 发生 和新的G产物 量的变化：产物增加 癌基因,86,原癌基因激活方式:,（1）基因扩增（amplification）：原癌基因因某种原因自身扩增而过度表达，基因扩增在细胞水平可在显微镜下观察到:双微体（double minute chromosome,DM）和均染区（homogeneously stain regions,HSR）。,87,DM andHSR,88,检测EGFR基因扩增,89,FISH-检测EGFR基因扩增,90,FISH-检测EGFR基因扩增,91,例如：,乳腺癌 erbB2 神经纤维瘤 N-myc 神经母细胞瘤 c-myc 高于正常140倍 小细胞肺癌 c-myc 高于正常4-6倍 亚 型 高于正常 20-76倍目前已知有多种癌基因扩增，如ras家族myc家族等。扩增范围从几倍到100倍以上。,92,（2）突变激活,体细胞内的原癌基因，因点突变而激活成为癌基因，产生异常的基因产物，也可因点突变使基因摆脱正常的调控而过度表达。例如：H-ras基因是ras基因家族成员之一，产物是p21蛋白(RAS蛋白)，通常有12、13和61位密码子突变。原癌基因 癌基因 M 12 GGT GCT 甘氨酸 缬氨酸,93,ras基因及产物的调节机制：,ras基因（活性）信号传导 细胞活动 ras蛋白+GTP GTP-RAS 细胞应答过度(ras蛋白具有GTPase 快速转变 细胞生长、增殖活性，突变后活性降低 转变慢）GDP-RAS 失控（失活）癌,94,ras基因及产物的调节机制,95,研究认为，点突变是癌发生的始动因素，即早期变化。但还不足以引发癌的产生，还需要其它遗传损伤。（3）染色体重排（chromosome rearrangement）肿瘤细胞遗传学研究表明，大多数肿瘤都存在染色体数目和结构异常，其随机改变反映了基因组不稳定性。另外，已知150多种特异的肿瘤染色体断裂点。染色体断裂重排涉及某些原癌基因的激活。,96,例：90%以上的CML，t(9;22)，形成嵌合基因BCRABL嵌合基因所编码的酪氨酸激酶，对正常控制无应答反应,97,转座（transoposition）到活性染色质区而激活,如：Burkitts Lymphoma t（8；14）（q24；q32），75%85%患者。8号染色体上的myc基因易位至14号染色体长臂上IgH基因旁，在B细胞该区是活性转录区，导致myc基因过度表达。,98,（4）启动子插入,一个细胞原癌基因附近一旦被插入一个强有力的启动子即被激活。鸟类白细胞增生病毒（ALV）例如：1日龄鸡 产生B细胞淋巴瘤 ALV没有癌基因只有一个强有力的启动子，当ALV前病毒（provirus）一旦整合到细胞的癌基因旁，即可诱导细胞癌基因的表达。,99,1981年 Hayward 等证明：整合 ALV c-myc旁 表达高于正常细胞 30-100倍 1982年 Blain 研究证明：转化 克隆鼠细胞的c-mos基因 NIH3T3 细胞不转化 转化 c-mos基因 NIH3T3 细胞转化+LTR（病毒长末端重复序列）LTR 癌基因,100,2、肿瘤抑制基因（Tumor Suppression Gene-TSG）,存在于正常细胞中能够抑制细胞恶性转化，对细胞的增殖起负性调节作用的基因，其失活使正常细胞增殖失控，进而转化形成肿瘤细胞。其作用恰好与癌基因相反，失活的TSG（突变、丧失功能）常发现于人类肿瘤样本中。这些基因编码抑制细胞增殖的蛋白,形成肿瘤细胞。,101,TSG：在正常情况下对细胞的繁殖具有负调节作用，抑制癌基因。Sager于1990年指出，在癌的发生过程中，需要基因改变，即癌基因的激活和抑癌基因的失活或丢失，二者在细胞繁殖的调控中起着正负信号的调节作用。现有抑癌基因30多种。抑癌基因的发现和深入研究乃是癌分子遗传学的一重大突破，很大程度上回答了癌发生这个长期难以解答的问题。,102,1）TSG的发现及其研究途径（TSG存在的证据）,肿瘤的发生不仅仅涉及显性癌基因激活，而且还涉及其它隐性基因的功能丧失，这其它基因就是抑癌基因。,103,细胞融合实验,Harris（1971年）和Klein等20年前实验 鼠正常细胞肿瘤细胞 丧失成瘤性 鼠 杂种细胞（表型正常）继续培养 形成肿瘤 鼠 出现逆分化（肿瘤表型）肿瘤的抑制与正常染色体存在着相关性，正常染色体上有抑制肿瘤效应的遗传物质TSG。逆向发生肿瘤现象可能是杂种细胞中携带抑癌基因丢失。,104,Stolet和Shimizu微细胞转移实验,微细胞（含单个染色体）转移 肿瘤细胞 肿瘤生长抑制。证明抑制基因存在于单个染色体上，并将TSG 在染色体上定位。,105,例 如：,肿瘤细胞 转移染色体 肿瘤生长抑制视网膜母C瘤 13+Wilms 11+神经母细胞瘤 17+,106,家族性癌的研究,A。视网膜母细胞瘤Rb Gene 是最早发现的TSG，证据来自于对视网膜母细胞瘤的研究。,107,遗传型 散发型,108,与Knodson二次打击学说是一致的，Rb Gene缺失或功能丧失，失去对肿瘤细胞的抑制作用，认为Rb Gene 为TSG。,109,B、Wilms 瘤,在Wilms瘤患者中发现11p13-，WT1 Gene定位于11p13 区域，认为WT1为 TSG。WT1 10个外显子，50kb，传录本 3kb，编码4649a的蛋白质。,110,、家族性腺瘤样息肉,家族性腺瘤样息肉（familial adenomatouspolyposis）ene定位于p，即 基因，转录本.4kb,编码2844Aa的蛋白 质，其突变引起家族性腺瘤样息肉 癌.APC基因被认为是TSG。,111,杂合性丢失,杂合性丢失（Loss of heterozygosity,LOH）应用于检测、鉴定TSG。LOH：杂合时某一等位基因片段丢失。,112,LOH：杂合时某一等位基因片段丢失,113,114,LOH,115,PCR产物序列分析,116,视网膜母细胞瘤的遗传分析,前三种情况（1、2和3），肿瘤组织中正常等位基因丢失（A），这称为杂合性丢失。,117,118,25个遗传标记-10个病例,119,选择遗传标记跨基因（TSG），遗传标记与侯选TSG 相邻，遗传标记的缺失就意味着TSG丢失，在肿瘤细胞中LOH 提示TSG 的存在，在染色体某一区域LOH频率高，可能为TSG 的侯选位点。LOH 的方法坚定了p53 Gene，位于17p12 APC Gene位于5q21 等,LOH MI（Microsatellite instability）N T N T,LOH,MI,120,2）TSG 的功能,细胞粘附分子，APC、DCC-TSG C周期调控，RB、p53-TSG 参与细胞周期复杂调控，即作为一种负性调节因子（negative regulation）。其中RB基因和P53基因在细胞周期调控进展中起重要作用，它们的产物在肿瘤细胞中经常同时失活。,121,RB Gene产物的功能,RB Gene 转录 mRNA 翻译 110kD(pRb核蛋白)调控 细胞增殖 RB广泛表达，编码110Kda核蛋白pRB。对控制细胞增殖起重要作用。,122,Rb Gene Rb Gene 突变 Cyclin（CDK，CKI）磷酸化 pRb蛋白 pRb蛋白（激活）去磷酸化（失活）pRb降解 病毒蛋白 EIA/SV40T E2F MDM2Gene扩增，Gene产物抑制pRb 调节 G1期 癌基因变化 DNA损伤 S期 C增殖 P53 失 控 Apoptosis 复制终止 C过度增殖 直至修复 癌变,123,磷酸化A正常情况 pRb激活 失活 去磷酸化,它的部分作用是调控一组细胞转录因子-E2F。细胞周期进入S期前（2-4hr）pRb 磷酸化而失活，解除对E2F的抑制使细胞进入S期。,124,B、磷酸化是由一套Cyclin、CDK激酶、CKI控制，即控制细胞周期中重要的检 控点（checkpoint）。C、MDM2癌基因与pRb结合并抑制pRb，而有利细胞周期进展。D、某些病毒癌基因蛋白EIA、SV40T抗原，人乳头了瘤病毒E7蛋白相结合，使pRb降解，或直接使pRb基因突变功能丧失。,125,p53与细胞凋亡:在Gene 控制下细胞程序化死亡。,A、停止细胞复制损伤的DNA。B、参于细胞周期G1/S阶段的Checkpoint（细胞缺少p53或含有其突变时，就不能停止于G1期），而损伤DNA的复制可导致遗传的变化。C、与细胞死亡有关，调节细胞凋亡。这是高水平的细胞结构自然选择的防御。癌的发生就是这一控制功能的丧失。证明缺乏p53的细胞不能进行凋亡。现已发现有30多种TSG，近年发现的有FHIT、PTEN（MMAC1）等。,126,127,128,129,P53基因与其它基因间的相互作用,130,3、增变基因,增变基因：在确保遗传信息的完整性上起一定作用，其突变导致DNA复制和修复障碍。长期以来，肿瘤表现遗传不稳定性：数目异常 核型异常 结构异常 都和增变基因突变相关。LOH DNA MI,131,增变基因,1993年Fishel在E.Coli和yeast中发现,并将MutHLS基因称为mutater gene。这些基因编码一种错误改正系统-检查DNA错配的碱基对。增变基因突变会导致1001000倍突变率的增加。故现在又称为DNA错配修复基因。Fishel等克隆了人的这一同源基因，Muts,并定位于2P，并迅速鉴定了另三个这样基因。,132,结肠癌的mutator gene。,Ecoli 人 染色体的位置%HNPCCMuts MSH2 2P15-P22 50-60%Mutl MLH1 3P21.3 30,40%Mutl PMS1 2p31-p33 5%Mutl PMS2 7p22 5%与TSG一样，这类基因突变是隐性的，亦需要两次打击机制。,133,错配修复基因（mismatch repair gene，MMR）,DNA错配修复系统（MMR首先是在原核生物中发现)Mut SMMR系统 Mut L 也称 Mut SLH 途径。MutH该系统的修复机制主要依赖于Mut S、MutL、MutH，基因所编码的蛋白、酶分子来完成。MutS其蛋白的作用是识别错配的碱基位点并与 之结合。而后MutL 和MutH基因产物依次与MutS形成复合物 进行协同作用。,134,A G N A T T C G T A MutS Mut H A G N A T T C G T A Mut L,135,另外，该系统还需要其它酶和因子参与,DNA聚合酶III；如：DNA连接酶；单链结合蛋白；外切酶等，从而共同完成修复反应。,136,人类MMR系统：,现已阐明，人类MMR基因编码的错配修复蛋白可相互作用，形成一种多聚复合物，参与细胞错配修复反应。修复：修复DNA复制过程中出现的碱 作用 基错配。消除：消除由于简单重复序列之间的 遗传重组出现的不配对基碱序列。,137,目的,从而有效地防止DNA复制差错的产生。人体细胞中DNA 错配修复反应过程依赖于几种人类MMR基因产物，因此，其中任何一种基因发生突变导致其产物的功能丧失，将造成DNA错配，修复功能的异常、缺陷、或丧失。,138,人类MMR基因定位：,Gene location Exon ORF 产物 HMSH2 2p16 16 2802bp 934 aa HMLH1 3p21.3 19 2268bp 756 aa HPMS1 2q31-q33?2795bp 932aa HPMS2 2p22?2586bp 862aa,139,人类MMR系统与肿瘤,DNA 错配修复基因的完整性对确保DNA复制的精确性极为重要。DNA MMR系统 Gene 突变 MMR系统缺陷 修复功能下降 MI 肿瘤易感性增强,140,微卫星不稳定（Microsatellite DNA instability,MI）,微卫星不稳定（Microsatellite DNA instability,MI）是指T组织和N组织相比，其DNA等位结构发生简单重复序列的改变，这种改变表现在肿瘤组织与其对应的正常组织PCR产物经电泳后，电泳带出现增加或减少、位置及带的密度变化。N T LOH MI,141,MMR基因的作用方式类似于肿瘤抑制基因.MMR基因功能丧失需要两次突变事件。例如：在家族性遗传性非息肉型结肠癌（HNPCC）形成过程。第一次突变（生殖C）MMR Gene突变，个体对结肠癌易患倾向 第二次突变（体C）另一等位基因突变 纯合子，功能丧失 原癌基因、抑癌基因突变快速积累 细胞增殖失调74例HNPCC家系中研究表明，复制差（RER）阳性率高达92%说明MMR Gene 发生突变。,142,4.肿瘤转移基因和肿瘤转移抑制因,某些肿瘤发展到一定阶段可发生转移，恶性肿瘤的转移是一个复杂的过程，包括癌细胞由原发性脱落，进入细胞外基质和血管或淋巴管，并在远处适宜的组织中生长。近年来研究发现，存在着促进转移的肿瘤转移基因（Tumor metastasis gene）和抑制肿瘤转移的肿瘤转移抑制基因（Tumor metastasis suppressor gene）,143,1）肿瘤转移基因,1989年从转移性小鼠乳腺癌细胞中分离出一种与转移相关的基因S100A4(又称为CAL、p9ka、mtsI)。编码Ca2+结合蛋白促进C运动，影响细胞与细胞外基质粘附，改变蛋白水解活性促进转移。S100A4表达与人乳腺癌、结肠直肠癌的侵袭转移能力呈正相关。,144,2）肿瘤转移抑制基因,又在人和小鼠中发现,nm23基因的表达与乳腺癌等肿瘤的转移密切相关。表达降低与人类的某些肿瘤转移力增强有关。nm23 Gene17q21，编码17kd蛋白。,145,五、癌的多阶段演化（multistep evolution）,肿瘤的发生涉及多阶段、多基因参与的复杂过程，以结肠直肠癌为例说明其过程：,146,癌的多阶段演化,147,癌的多阶段演化,5chr LOH DNA低甲基化正常结肠细胞 C生长增强 早期腺瘤 APC k-ras基因激活 18 c