酶的非水相催化.ppt
Chapter 6 Enzymatic catalysis in Non-aqueous system,酶的非水相催化,制作：郑穗平,Contents of chapter 6,1、酶催化反应的介质,2、有机介质反应体系,3、酶在有机介质中的催化特性,4、有机介质中酶催化反应的条件及其控制,Go,Go,Go,Go,5、酶非水相催化的应用,Go,6.1 酶催化反应的介质,水是酶促反应最常用的反应介质。,但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。,由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。,是否存在非水介质能保证酶催化？,1984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。,酶非水相催化的几种类型,有机介质中的酶催化 有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。,超临界介质中的酶催化 酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。,离子液介质中的酶催化 酶在离子液中进行的催化作用。离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。,本章目录,气相介质中的酶催化 酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。,6.2 有机介质反应体系,非极性有机溶剂酶悬浮体系(微水介质体系)用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机相中。但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在固体载体表面上。与水互溶的有机溶剂水单相体系有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。非极性有机溶剂水两相/多相体系由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所组成的两相体系。,不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。,反应体系含1-三甲基硅-1-乙醇10 mM，戊酸10 mM，内标正十五烷，脂肪酶50 mg，30，120 rpm条件下振荡反应1：水饱和正已烷10 ml，2pH7.2缓冲液5 ml+正已烷10 ml,反应体系对酶酯化反应的影响,反应体系中水对酶催化反应的影响,酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。故此，酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential water）。有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。存在最适水含量。,反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响,常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以较好地保持其完整的空间结构。在有机溶剂中，酶分子不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应。根据酶分子的特性和有机溶剂的特性的不同，保持其空间结构完整性的情况也有所差别。极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶的变性失活。因此应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水量，或者经过酶分子修饰提高酶分子的亲水性，避免酶在有机介质中因脱水作用而影响其催化活性。有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。,本章目录,6.3 酶在有机介质中的催化特性,酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别，对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性,底物特异性立体选择性区域选择性键选择性热稳定性,酶在有机介质中由于水分子的减少，相对来说酶分子的构象表现出比水溶液中更具有“刚性”特点。因而使通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些特性成为可能。例如在有机溶剂中，可以利用酶与配体的相互作用性质，诱导改变酶分子的构象，调控酶的底物专一性,、立体选择性和手性选择性等。,由于引起酶变性的许多因素都与水的存在有关,因此在有机介质中酶的稳定性得到显著提高。,由于有机溶剂的存在,水量减少，大大降低了许多需要水参与的副反应，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基转移等。,在有机介质中进行的酶促反应，可以省略产物的萃取分离过程,提高收率。,有机介质酶催化反应的优点,某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性,本章目录,6.4 有机介质中酶催化反应的条件及其控制,酶在有机介质中可以催化多种反应，主要包括：合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应等。主要应控制的条件有酶的种类和浓度底物的种类和浓度有机溶剂的种类水含量温度pH离子强度,本章目录,6.5 酶非水相催化的应用,手性药物两种对映体的药理作用,1992年，美国FDA明确要求对于具有手性特性的化学药物，都必需说明其两个对映体在体内的不同生理活性、药理作用以及药物代谢动力学情况。许多国家和地区也都制定了有关手性药物的政策和法规。这大大推动了手性药物拆分的研究和生产应用。目前提出注册申请和正在开发的手性药物中，单一对映体药物占绝大多数。,脂肪酶-位置选择性酯化反应,葡萄糖苷-6-O-酰基衍生物是一种可生物降解的非离子表面活性剂，它可以用脂肪酸和葡萄糖苷在脂肪酶催化下进行选择性酯化得到：,糖酯的合成,脂肪酶-消旋化合物选择性酯化,以2-取代-1,3-丙二醇和脂肪酸为原料，在有机溶剂介质中用脂肪酶(CCL)或猪肝酯酶（PLE）催化酯化反应，可得到较高光学纯度的R-或S-酯。,脂肪酶-消旋化合物的拆分,有机介质中用脂肪酶(PSL)催化酯化用于-羟基-,-不饱和酯的拆分。可以避免副反应的发生。,脂肪酶-内酯合成反应,-羟基酸或它的酯在脂肪酶催化下，发生分子内环化作用得到内酯化合物。内酯可继续反应形成开链寡聚物.内酯化产物形式主要取决于羟基酸的长度外，也取决于脂肪酶的类型、溶剂及温度等。,生物柴油,生物柴油是利用生物油脂生产的有机燃料，是由动物、植物或微生物油脂与小分子醇类经过酯交换反应而得到的脂肪酸酯类物质。可以代替柴油作为柴油发动机的燃料使用。,生物油脂的来源：菜子油，豆油，椰子油，棕榈油、蓖麻油、棉籽油，葵花籽 油，废食用油等,优点：（1）具有良好的环境属性（2）具有较好的低温发动机启动性能。（3）具有较好的润滑性能。（4）具有较好的安全性能。（5）具有良好的燃料性能。（6）具有可再生性能。,从生物质到生物柴油,生物柴油生产装备,生物柴油的生产方法,目前生物柴油主要是用化学法生产，采用酸、碱催化油脂与甲醇之间的转酯反应，而生成脂肪酸甲酯。反应时间短，成本低。但在反应过程中使用过量的甲醇，而使后处理过程变得较为繁杂。能耗高；色泽深，在高温下容易变质；酯化产物难于回收；生产过程有废碱液排放新方法：生物酶法，在有机介质中，脂肪酶可以催化油脂与小分子醇类的酯交换反应，生成小分子的酯类混合物。条件温和，醇用量小、无污染排放。缺点：对甲醇及乙醇的转化率低，一般仅为40%60%，酶的使用寿命短。副产物甘油和水难于回收，不但对产物形成抑制，而且甘油对固定化酶有毒性，使固定化酶使用寿命短。,本章目录,酵母展示脂肪酶在短链芳香酯合成的应用,无溶剂体系中不同酸醇摩尔比对合成己酸乙酯的影响,无溶剂体系下酶催化合成芳香酯,Chapter 7 Reactors for enzymatic catalysis酶反应器,制作：郑穗平,Contents of chapter 5,1、什么是酶反应器,2、理想的酶反应器的要求,3、各种酶反应器的特点,4、酶反应器的选择和使用,Go,Go,Go,Go,5、酶反应器的设计,Go,7.1 什么是酶反应器,酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催化反应的速度。,用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。,酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。它为酶催化反应提供合适的场所和最佳的反应条件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地转化成产物。它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。,酶催化反应过程示意图,过程调控,生物反应器,消毒,原料预处理,产物分离提纯,产品,生物催化剂制备,空气,除菌,能量,热量,回本章目录,7.2 理想的酶反应器的要求,生物反应器设计的主要目标：使产品的质量最高，生产成本最低。评价生物反应器的主要标准：反应器生产能力的大小和产品质量的高低。,(4)应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染使反应器的生产能力下降。,(1)所用生物催化剂应具有较高的比活和酶浓度（或细胞浓度），才能得到较大的产品转化率。,(2)能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件。,(3)应具有良好的传质和混合性能。传质是指底物和产物在反应介质中的传递。传质阻力是反应器速度限制的主要因素。,常见的酶反应器类型,按结构区分搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor,STR）鼓泡式反应器(bubble column reactor,BCR)填充床式反应器(packed column reactor,PCR)流化床式反应器(Fluidized Bed Reactor,FBR)膜反应器(Membrane Reactor,MR)按操作方式区分分批式反应(batch)连续式反应(continuous)流加分批式反应(feeding batch)混合形式连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Reactor,CSTR）分批搅拌罐反应器（Batch Stirred Tank Reactor,BSTR）,回本章目录,7.3 各种酶反应器的特点,(1)间歇式酶反应器,又称为批量反应器（Batch Reactor BSTR）、间歇式搅拌罐、搅拌式反应罐。其特点是：底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。优点是：装置较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅速达到稳态。缺点是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。,(2)连续式酶反应器,又称为连续搅拌釜式反应器（Continuous Stirred Tank Reactor,CSTR）、连续式搅拌罐。向反应器投入固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液（含产物）。优点是：在理想状况下，混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致。缺点是：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒。,底物溶液进口,反应液出口,(3)填充床反应器,填充床反应器（Packed Reactor,PBR）,又称固定床反应器。将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液（含产物）。优点是：高效率、易操作、结构简单等，因而，PBR是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应。缺点是：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶度含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBR。,(4)流化床反应器,流化床反应器（Fluidized Bed Reactor,FBR）。特点是：底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。其流动方式使反应液的混合程度介于CSTR的全混型和PBR的平推流型之间。FBR可用于处理黏度较大和含有固体颗粒的底物溶度，同时，亦可用于需要供气体或排放气体的酶反应（即固、液、气三相反应）。但因FBR混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反应。,(5)鼓泡式反应器,鼓泡式反应器(bubble column reactor,BCR)是利用从反应器底部通入的气体产生的大量气泡，在上升过程中起到提供反应底物和混合两种作用的一类反应器。也是一种无搅拌装置的反应器。鼓泡式反应器可以用于游离酶和固定化酶的催化反应。在使用鼓泡式反应器进行固定化酶的催化反应时，反应系统中存在固、液、气三相，又称为三相流化床式反应器。鼓泡式反应器的结构简单，操作容易,剪切力小，物质与热量的传递效率高，是有气体参与的酶催化反应中常用的一种反应器。例如氧化酶催化反应需要供给氧气，羧化酶的催化反应需要供给二氧化碳等。,(6)膜反应器,膜反应器（membrane reactor,MR）是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应器。膜反应器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纤维型、转盘型等多种形状。常用的是中空纤维反应器。,连续搅拌罐超滤膜反应器 简称CSTR-UFR。在CSTR（连续式搅拌罐）出口处设置一个超滤器。可以将小分子产物与大分子酶和底物分开，有利于产物回收。该反应器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。,游离酶在膜反应器中进行催化反应时，底物溶液连续地进入反应器，酶在反应容器的溶液中与底物反应，反应后，酶与反应产物一起，进入膜分离器进行分离，小分子的产物透过超滤膜而排出，大分子的酶分子被截留，可以再循环使用。,回本章目录,7.4 酶反应器的选择和使用,影响酶反应器选择的因素很多，但一般可以从以下几个方面考虑：酶的形式(游离/固定化.)固定化酶的形状底物的物理性质酶反应动力学性质酶的稳定性操作要求反应器制造、控制成本,通常颗粒状、片状、膜状或纤维状固定化酶均可采用填充床反应器（PBR），而颗粒状、粉末状及片状固定化酶均可使用于连续式搅拌罐（CSTR），膜状固定化酶要用螺旋卷膜式反应器。,在应用游离酶进行催化反应时，酶与底物均溶解在反应溶液中，通过互相作用，进行催化反应。可以选用搅拌罐式反应器、膜反应器、鼓泡式反应器、喷射式反应器等。,可溶性底物适用于所有的反应器。难溶底物或者底物溶液呈胶体状者，易堵塞柱床，可选用FBR。颗粒状底物溶液可适用于CSTR。当反应过程需要控制温度、调节pH时，选用CSTR更为方便。,在反应器操作过程中，由于搅拌或液流的剪切作用，常会使酶从载体上脱落下来，或者由于磨损而使粒度变细，从而影响了固定化酶的操作稳定性。,酶反应器使用中应注意的问题,酶的稳定性对酶反应器的功效是很重要的。在操作过程中，有时需要用酸或碱来调节反应液PH。如果局部的pH过高或过低，就会引起酶的失活，或者使底物和产物发生水解反应。这时，可用加快搅拌已促使混合均匀。如果底物和产物在反应器中不够稳定的话，可以采用高浓度的酶，以减少底物和产物在反应器中的停留时间，从而减少损失。防止微生物污染酶反应器操作中，生产能力逐渐降低，主要原因是固定化酶活性降低或损失。造成固定化酶活性损失的原因：（1）酶本身的失活；（2）酶从载体上脱落；（3）载体的破碎或溶解。,回本章目录,7.5 酶反应器的设计,1、确定酶反应器的类型酶反应器的设计，首先要根据酶、底物和产物的性质，按照上一节所述的选择原则，选择并确定反应器的类型。2、确定反应器的制造材料由于酶催化反应具有条件温和的特点，通常都是在常温、常压、pH近乎中性的环境中进行反应，所以酶反应器的设计对制造材料没有什么特别要求，一般采用不锈钢制造反应容器即可。3、进行热量衡算酶催化反应一般在3070的常温条件下进行，所以热量衡算并不复杂。温度的调节控制也较为简单，通常采用一定温度的热水通过夹套（或列管）加热或冷却方式，进行温度的调节控制，热量衡算是根据热水的温度和使用量计算。对于某些耐高温的酶，例如高温淀粉酶，可以采用喷射式反应器，热量衡算时，根据所使用的水蒸气热焓和用量进行计算。4、进行物料衡算酶反应动力学参数/底物用量/酶量/反应体积/反应器数量,回本章目录,
