酶工程第三章酶的生物合成法生产.ppt

酶工程Enzyme Engineering,林范学,1/50,2,2/50,酶的生产方法：,微生物细胞发酵产酶植物细胞发酵产酶动物细胞发酵产酶,提取分离法生物合成法化学合成法,生物合成法：,第三章 酶生物合成法生产,3,酶的生物合成（biosynthesis）通过细胞的生命活动合成各种酶的过程酶的生物合成法生产经过预先设计，通过人工操作，利用微生物、植物及动物细胞的生命活动，获得所需酶的技术过程，称为酶的生物合成法生产,3/50,第三章 酶生物合成法生产,4,第三章 酶生物合成法生产,第一节 细胞的选择第二节 培养基的配制第三节 产酶工艺条件及其调节控制第四节 微生物发酵产酶第五节 植物细胞培养产酶第六节 动物细胞培养产酶,4/50,5,第一节 细胞的选择,优良产酶细胞应具备的条件（1）酶的产量高（2）容易培养和管理（生长速率高、营养要求低）（3）产酶稳定性好，不易退化（4）利于分离提纯（5）安全可靠，无毒性,6,一、微生物,常用的产酶微生物,7,一、微生物,微生物酶的种类大众工业用酶：淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、纤维素酶和木聚糖酶,8,一、微生物,1、大肠杆菌（Escherichia coli）谷氨酸脱羧酶：测定谷氨酸含量或用于生产氨基丁酸 天冬氨酸酶：催化延胡索酸加氨生产L-天冬氨酸 青霉素酰化酶：用于生产新的半合成青霉素或头孢霉素天冬酰胺酶：对白血病具有显著疗效-半乳糖苷酶：用于分解乳糖或其他-半乳糖苷限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等：在基因工程等方面广泛应用。,9,一、微生物,2、枯草杆菌（Bacillus subtilis）枯草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物-淀粉酶蛋白酶-葡聚糖酶5-核苷酸酶碱性磷酸酶,10,一、微生物,3、链霉菌（Streptomyces）葡萄糖异构酶：主要生产微生物青霉素酰化酶纤维素酶碱性蛋白酶中性蛋白酶几丁质酶16羟化酶：可用于甾体转化,11,一、微生物,4、黑曲酶（Aspergillus niger）可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶糖化酶-淀粉酶酸性蛋白酶果胶酶葡萄糖氧化酶过氧化氢酶,核糖核酸酶脂肪酶纤维素酶橙皮苷酶柚苷酶等。,12,一、微生物,5、米曲霉（Aspergillus oryzae）糖化酶和蛋白酶的活力：传统的酒曲和酱油曲的制造中广泛应用氨基酰化酶磷酸二酯酶果胶酶核酸酶P,13,一、微生物,6、青霉菌（Penicillium）产黄青霉（Penicillium chrysogenum）葡萄糖氧化酶苯氧甲基青霉素酰化酶果胶酶纤维素酶,桶青霉（Penicillium cityrinum）5-磷酸二酯酶脂肪酶葡萄糖氧化酶凝乳蛋白酶核酸酶S1核酸酶P1,14,一、微生物,7、木霉（Trichoderma）纤维素酶：重要生产菌株，包含有Cl酶、Cx酶和纤维二糖酶等。17-羟化酶：常用于甾体转化。,15,一、微生物,7、根霉（Rhizopus）糖化酶-淀粉酶蔗糖酶碱性蛋白酶核糖核酸酶,脂肪酶果胶酶纤维素酶半纤维素酶11-羟化酶：用于甾体转化的重要菌株。,16,一、微生物,9、毛霉（Mucor）蛋白酶糖化酶-淀粉酶脂肪酶果胶酶凝乳酶,17,一、微生物,10、红曲霉（Monascus）-淀粉酶糖化酶麦芽糖酶蛋白酶,18,一、微生物,11、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）主要用于啤酒、酒类的生产转化酶丙酮酸脱羧酶醇脱氢酶,19,一、微生物,12、假丝酵母（Candida）脂肪酶尿酸酶尿囊素酶转化酶醇脱氢酶17经化酶：可以用于甾体转化。,20,二、植物细胞,主要用于色素、药物、香精和酶等初级代谢产物的生产。,21,三、动物细胞,动物细胞培养主要用于生产疫苗、激素、多肽、酶等酶：纤溶酶原激活剂（tPA）、胶原酶、尿激酶等。产酶细胞人黑色素瘤细胞中国仓鼠卵巢细胞（CHO）小鼠骨髓瘤细胞牛内皮细胞,22,第二节 培养基的配制,培养基（culture medium）是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。,23,一、培养基的基本成分,1、碳源（carbon source）能为细胞提供碳素化合物的物质。细胞构成、酶的组成，也提供能源微生物：淀粉、糊精、淀粉水解糖、麦芽糖、葡萄糖植物细胞：蔗糖动物细胞：谷氨酰胺、谷氨酸,24,2、氮源（nitrogen source）向细胞提供氮元素的营养物质。蛋白质、核酸、酶的组成成分。有机氮：蛋白质及其水解物，如蛋白胨、酵母膏等。无机氮：含氮的无机物，如氨水、硫酸铵等。动物细胞：氨基酸、蛋白胨等有机氮植物细胞：铵盐、硝酸银等无机氮微生物：异养型：有机氮自养型：无机氮,25,3、无机盐（inorganic salt）是提供细胞生命活动所必不可缺的各种无机元素，并对细胞内外的pH、氧化还原电位和渗透压起调节作用。大量元素(0.5mmol/L)：P，S，K，Na，Ca，Mg，Cl等元素微量元素(0.5mmol/L)：Cu，Mn，Zn，Mo，Co，B，I,26,4、生长因素（growth factor）即生长因子，是指细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物。氨基酸：蛋白质组分嘌呤、嘧啶：核酸、辅酶、辅基的组分维生素：起辅酶作用生长激素：起细胞生长、分裂的调节作用,27,二、微生物培养基,用于微生物培养和发酵生产的各种培养基的总称。碳源：淀粉或其水解物氮源：含有有机氮和无机氮的混合氮源无机盐和生长因子：根据需要添加,28,三、植物细胞培养基,1、植物细胞培养基特点（与微生物培养基的不同点）（1）植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐：大量元素：P、S、N、K、Na、Ca、Mg等大量元素：浓度一般为1023103mg/L微量元素：Mn、Zn、Co、Mo、Cu、B、I等：浓度一般为10-230 ng/L。（2）植物细胞需要多种维生素和植物生长激素：维生素：如琉胺素（VB1）、吡哆素（VB6）、烟酸、肌醇：浓度一般为0.1100mg/L）；生长激素：生长素、分裂素：浓度一般为0.110mg/L，（3）植物细胞要求的氮源一般为无机氮源：即可以同化硝酸盐和铵盐。（4）植物细胞一般以蔗糖为碳源：蔗糖的浓度一般为2%5%。,29,2、几种常用的植物细胞培养基（1）MS培养基：MS培养基是1962年由Murashinge和Skoog为烟草细胞培养而设计的培养基。其特点是硝酸盐（硝酸钾、硝酸铵）的浓度比其他培养基高，广泛应用于植物细胞、组织和原生质体培养。（2）B5培养基：B5培养基是1968年Gamborg等人为大豆细胞培养而设计的培养基。其主要特点是铵的浓度较低，适用于双子叶植物特别是木本植物的组织、细胞培养。（3）White培养基：White培养基是1934年由White为番茄根尖培养而设计的培养基。1963年作了改良，提高了培养基中MgSO4 的浓度，增加了微量元素硼（B）。其特点是无机盐浓度较低，适用于生根培养。（4）KM-8P 培养基：KM-8P培养基是1974年为原生质体培养而设计的培养基。其特点是有机成分的种类较全面，包括多种单糖、维生素和有机酸，在原生质体培养中广泛应用。,30,3植物细胞培养基的配制（1）大量元素母液：即是含有N、P、S、K、Ca、Mg、Na等大量元素的无机盐混合液。由于各组分的含量较高，一般配制成10倍浓度的母液。在使用时，每配制成1000mL培养液，吸取100mL母液。（2）微量元素母液：即含有B、Mn、Zn、Co、Cu、Mo、I等微量元素的无机盐混合液。由于各组分的含量低，一般配制成100倍浓度的母液。在使用时，每配制1000mL培养液，吸取10mL母液。（3）铁盐母液：由于铁离子与其他无机元素混在一起放置时，容易生成沉淀，所以铁盐必须单独配制成铁盐母液。铁盐一般采用螯合铁（Fe-EDTA）。通常配制成100倍（或200倍）浓度的铁盐母液，在使用时，每配制1000mL培养液，吸取10m1（或5mL）铁盐母液。（4）维生素母液：是各种维生素和某些氨基酸的混合液。一般配制成100倍浓度的母液。在使用时，每配制1000mL培养液，吸取10mL母液。（5）植物激素母液：各种植物激素单独配制成母液。一般浓度为100 mg/L。使用时根据需要取用。由于大多数植物激素难溶于水，需要先溶于有机溶剂或者酸、碱溶液中，再加水定容到一定的浓度。,31,3植物细胞培养基的配制（1）大量元素母液：含有N、P、S、K、Ca、Mg、Na等大量元素的无机盐混合液。配制成10倍浓度的母液。（2）微量元素母液：含有B、Mn、Zn、Co、Cu、Mo、I等微量元素的无机盐混合液。配制成100倍浓度的母液。（3）铁盐母液：由于铁离子与其他无机元素混在一起放置时，容易生成沉淀，所以铁盐必须单独配制成铁盐母液。铁盐一般采用螯合铁（Fe-EDTA）。通常配制成100倍（或200倍）浓度的铁盐母液。（4）维生素母液：是各种维生素和某些氨基酸的混合液。一般配制成100倍浓度的母液。（5）植物激素母液：各种植物激素单独配制成母液。一般浓度为100 mg/L。使用时根据需要取用。由于大多数植物激素难溶于水，需要先溶于有机溶剂或者酸、碱溶液中，再加水定容到一定的浓度。,32,四、动物细胞培养基,动物细胞培养体细胞 soma从动物体内取出部分组织，在一定条件下用胰蛋白酶消化处理，然后分离得到杂交瘤细胞 hybridoma首先分离肿瘤细胞和免疫淋巴细胞，再在一定条件下将肿瘤细胞和免疫 淋巴细胞进行细胞融合，然后筛选得到,33,1.动物细胞培养基的组成成分,(1)氨基酸(2)维生素(3)无机盐(4)葡萄糖(5)激素(6)生长因子,34,1.动物细胞培养基的组成成分,(1)氨基酸各种必需氨基酸（Lys,Phe,Leu,Ile,Val,Met,His,Try），以及Cys,Tyr,Gln等。其中谷氨酰胺为多数动物细胞作为碳源和能源利用，有些动物细胞则利用谷氨酸。(2)维生素动物细胞培养所需的各种维生素，在含血清的培养基中一般由血清提供；在血清含量低的培养基中或者在无血清的培养基中，必需补充B族维生素，有的还补充维生素C。,35,1氨基酸氮源作用不能利用:多肽、蛋白质等高分子聚合物。利用：氨基酸等单体化合物。12种是必需氨基酸：Arg、Cys、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr、Val。必须在培养基中添加，才能满足细胞的生长谷氨酰胺:重要碳源和能源。,36,2维生素作用：一类微量的小分子有机生物活性物，既不是细胞的物质基础，也不是能量物质，对代谢和生长起调节和控制作用。水溶性维生素：B族维生素和维生素C脂溶性维生素：维生素A、D、E、K四种。,37,3无机盐必需添加含有大量元素的无机盐，如Na+、K+、Ca2+、Mg2+、PO33-、SO42-、Cl-、HCO3-等，主要用于调节培养基的渗透压。而微量元素一般由血清提供，在无血清培养基或血清含量低的培养基中，则需要添加铁（Fe）、铜（Cu）、锌（Zn）、硒（Se）等。4葡萄糖大多数动物细胞培养基中含有葡萄糖，作为碳源和能源使用。但是葡萄糖含量较高的培养基在细胞培养过程中容易产生乳酸。研究表明，在动物细胞培养中，细胞所需的能量和碳素来自谷氨酰胺。,38,3无机盐作用：细胞代谢所需酶的辅基，调节酶活性，细胞构成成分；参与生理电活动；维持水平衡、保持渗透压和酸碱平衡。胞外无机盐对维持正常生长环境很重要。,39,4葡萄糖糖类提供细胞生长的碳源和能源，分解后释放出能量ATP。不同细胞对葡萄糖利用相似，在无氧条件下还产生乳酸等有机酸。不能利用:多糖、双糖、寡糖等聚合物。利用：单糖单体化合物。主要是葡萄糖,40,5激素动物细胞培养过程中需要胰岛素、生长激素、氢化可的松等激素。其中，胰岛素可以促进细胞对葡萄糖和氨基酸的吸收和代谢；生长激素与促生长因子结合，有促进有丝分裂的效果；氢化可的松可促进细胞就着和增殖，然而当细胞浓度较高时，氢化可的松可抑制细胞生长并诱导细胞分化。动物细胞培养所需的激素一般在血清中已经存在，但在低血清或者无血清培养基中必需添加适当的激素。6生长因子血清中含有各种生长因子，可以满足细胞的需要。在无血清或者低血清培养基中，需要添加适量的表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子等。,41,5.生长类因子与激素作用：对细胞的生长有刺激作用贴附因子：细胞的贴壁生长必需。脂类化合物：必需的，类脂及其前体和血清常平行使用。铁传递蛋白：离子载体。,42,2.动物细胞培养基的配制,配制母液如100倍浓度氨基酸母液、1000倍浓度维生素母液、100倍浓度葡萄糖母液（溶解于平衡盐溶液）等。混合母液在使用前，分别吸取一定体积的母液，混匀得到混合母液，膜过滤除菌后，冷冻备用；使用母液取一定体积的混合母液，用无菌的平衡盐溶液稀释至所需浓度。,43,确保完全溶解、不产生沉淀其他注意点：如果采用无血清培养基，则需要补充各种激素和生长因子等组分由于谷氨酰胺不稳定（在培养液中的半衰期，4时为3周，36.5时为1周），要单独配制并冷冻保存。,44,45,第三节 产酶工艺条件及其调节控制,选择性能优良的产酶细胞控制好各种工艺条件根据情况变化进行调节,46,酶生产的一般工艺流程,47,一、细胞活化与扩大培养,选育细胞细胞保藏斜面保藏法、沙土管保藏法、真空冷冻干燥保藏法、低温保藏法、石蜡油保藏法等保持细胞的生长、繁殖和产酶特性。细胞活化保藏的细胞接种到新鲜培养基上，在一定条件下进行培养，使细胞的生命活性得以恢复的过程。,48,扩大培养获得足够数量的优质细胞培养基：含有较为丰富的氮源、碳源扩大培养至细胞对数期，或孢子成熟期接种量：1%10%,49,二、pH的调节控制,1、不同细胞，其生长繁殖的最适pH值有所不同。细菌、放线菌：中性或碱性，pH6.58.0霉菌、酵母菌：偏酸性，pH46植物细胞：偏酸性，pH5.25.8动物细胞：偏碱性，pH7.27.6,50,2、细胞产酶最适pH值与生长最适pH值往往不同。细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值。碱性蛋白酶：碱性（pH 8.59.0）中性蛋白酶：中性或微酸性（pH 6.07.0），酸性蛋白酶：酸性（pH 46）例外：有些酶在其催化反应的最适条件下，产酶细胞的生长和代谢可能受到影响如枯草杆菌碱性磷酸酶，其催化反应的最适pH值为9.5，而其产酶的最适pH值为7.4,51,3、有些微生物可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pH，可改变各种酶之间的产量比例。,黑曲霉-淀粉酶 糖化酶pH值中性 pH值偏酸性,米曲霉 蛋白酶pH值碱性碱性蛋白酶pH值中性 中性蛋白酶pH值偏酸性 酸性蛋白酶,52,4、随着细胞的生长、繁殖和新陈代谢产物的积累，培养基的pH值往往会发生变化。这种变化的情况与细胞特性有关，也与培养基的组成成分以及发酵工艺条件密切相关。例如，含糖量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸，会使pH值向酸性方向移动；含蛋白质、氨基酸较多的培养基，经过代谢产生较多的胺类物质，使pH值向耐性方向移动；以硫酸铵为氮源时，随着铵离子被利用，培养基中积累的硫酸根会使pH值降低；以尿素为氮源的，随着尿素被水解生成氨，而使培养基的pH值上升，然后又随着氨被细胞同化而使pH值下降；磷酸盐的存在，对培养基的pH值变化有一定的缓冲作用。在氧气供应不足时，由于代谢积累有机酸，可使培养基的pH值向酸性方向移动。,53,4、随着细胞的生长、繁殖和新陈代谢产物的积累，培养基的pH值往往会发生变化。,54,5、控制pH的方法：调节培养基组分或比例，保持一定的C/N比C/N高：发酵液倾向酸性C/N低：发酵液倾向碱性添加缓冲液维持一定的pH；调节通风量维持发酵液的氧化还原电位于一定范围；当发酵液pH过高时用糖或淀粉来调节，pH过低时，通过氮调节。,55,5、控制pH的方法：,56,三、温度的调节控制,1、不同的细胞有各自不同的最适生长温度枯草杆菌：3437黑曲霉：2832。嗜热微生物：40-50,57,三、温度的调节控制,1、温度确定原则,58,有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。例如，采用酱油曲霉生产蛋白酶，在28的温度条件下，其蛋白酶的产量比在40条件下高24倍；在20的条件下发酵，则其蛋白酶产量更高，但是细胞生长速度较慢。若温度太低，则由于代谢速度缓慢，反而降低酶的产量，延长发酵周期。所以必须进行试验，以确定最佳产酶温度。为此在有些酶的发酵生产过程中，要在不同的发酵阶段控制不同的温度，即在细胞生长阶段控制在细胞生长的最适温度范围，而在产酶阶段控制在产酶最适温度范围。,59,在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新陈代谢作用，会不断放出热量，使培养基的温度升高，同时，由于热量的不断扩散，会使培养基的温度不断降低。两者综合结果，决定了培养基的温度。由于在细胞生长和产酶的不同阶段，细胞新陈代谢放出的热量有较大差别，散失的热量又受到环境温度等因素的影响，使培养基的温度发生明显的变化。为此必须经常及时地对温度进行调节控制，使培养基的温度维持在适宜的范围内。温度的调节一般采用热水升温、冷水降温的方法。为了及时地进行温度的调节控制，在发酵罐或其他生物反应器中，均应设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等，并且随时备有冷水和热水，以满足温度调控的需要。,60,2、温度的控制方法热水升温，冷水降温。因此，在发酵罐中均设有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管，夹套、喷淋管等。,61,四、溶解氧的调节控制,1、溶解氧（soluble oxygen）是指溶解在培养基中的氧气。培养过程中细胞一般只能利用溶解在发酵液中的氧气。为了满足细胞生长繁殖和发酵产酶的需要，在发酵过程中必须不断供给氧（无菌空气），使培养基中的溶解氧保持在一定的水平。溶解氧的调节控制，就是要根据细胞对溶解氧的需要量，连续不断地进行补充，使培养基中溶解氧的量保持恒定。,62,“临界氧浓度”各种微生物对发酵液中的溶氧浓度有个最低要求，这个溶氧浓度称为“临界氧浓度”。低于这个浓度，影响微生物生长和产酶；溶氧量过高，一方面造成浪费，另一方面会抑制某些酶的生物合成。,发酵过程中溶氧无需达到饱和，只要求超过“临界氧浓度”。,63,2、溶解氧浓度决定因素,菌体浓度和菌龄 基质种类和浓度 培养条件,以菌浓影响最明显,需氧方面,供氧方面,调节搅拌转速调节通气速率,两大因素,64,3、耗氧速率KO2溶解氧的控制根据细胞对溶解氧的需要量来控制。用耗氧速率（KO2）表示：KO2 QO2CcKO2 耗氧速率 QO2 细胞呼吸强度 Cc细胞浓度,KO2：单位体积培养液中的细胞在单位时间内消耗的氧气量，单位（mmol氧/hL),QO2：单位细胞量（每个细胞，每克干细胞）在单位时间内消耗的氧气量，单位（mmol氧/hg干细胞或mmol氧/h每个细胞）,Cc：单位体积培养液中细胞量，单位（g干细胞/L或个细胞/L),65,4、溶氧速率Kd单位体积的发酵液单位时间内所溶解的氧的量(溶氧系数)。单位(mmol氧/hL）溶氧速率与通气量、氧分压、气液接触时间与面积、培养液的性质等有关。当KO2 Kd时，可满足细胞生长和产酶所需,66,5、调节溶氧速率的方法（1）调节通气量；（2）调节氧的分压；（3）调节气液接触时间；（4）调节气液接触面积；（5）改变培养液性质。,67,（1）调节通气量指单位时间内流经培养液的空气量（L/min）；培养液体积与每分钟通入的空气体积之比(VVm)表示。例如，1m3培养液，每分钟流经的空气量为0.5m3，即通气量为1：0.5；1L培养液，每分钟流经的空气为2L，则通气量为1：2等。在其他条件不变的情况下：增大通气量，可以提高溶氧速率减少通气量，能够降低溶氧速率。,68,（2）调节氧的分压提高氧的分压，可以增加氧的溶解度，从而提高溶氧速率。增加发酵容器中的空气压力增加通入的空气中的氧含量,69,（3）调节气液接触时间接触时间延长，提高溶氧速率。接触时间缩短，降低溶氧速率。增加液层高度降低气流速度在反应器中增设挡板延长空气流经培养液的距离,70,（4）调节气液接触面积接触界面，溶氧速率。使通过培养液的空气尽量分散成小气泡。底部安装空气分配管（主要方法）装设搅拌装置或增设挡板等打碎和分散气泡,71,（5）改变培养液的性质培养液的性质对溶氧速率有明显影响，若培养液的黏度大，在气泡通过培养液时，尤其是在高速搅拌的条件下，会产生大量泡沫，影响氧的溶解。降低黏度：改变培养液的组分或浓度等方法减少或消除泡沫：设置消泡装置或添加适当的消泡剂,72,第四节 微生物发酵产酶,酶的生物合成（biosynthesis）所有的生物体在一定的条件下都能产生多种多样的酶。酶在生物体内合成的过程称为酶的生物合成。酶的发酵生产（fermentation production）经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动获得所需酶的技术过程，称为酶的发酵生产。,73,一、微生物发酵产酶的方式及其特点二、提高产酶量的措施三、酶发酵动力学四、固定化微生物细胞发酵产酶五、固定化微生物原生质体发酵产酶,74,一、微生物发酵产酶的方式及其特点,大多数酶的生产采用发酵生产的原因：微生物具有种类多繁殖快易培养代谢能力强微生物发酵产酶的方式固体培养发酵液体深层发酵固定化细胞发酵固定化原生质体发酵,75,一、微生物发酵产酶的方式及其特点,（一）微生物发酵产酶的特点1.微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。2.微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。3.微生物容易培养，培养基来源广泛、价格便宜。4.自动化控制，可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高。5.基因工程育种和开发新酶，可以利用以基因工程为主的近代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种。,76,（二）微生物发酵产酶的方式固体培养发酵液体深层发酵固定化细胞发酵固定化原生质体发酵,77,1.固体培养发酵是在固体或者半固体的培养基中接种微生物，在一定条件下进行发酵，以获得所需酶的发酵方式。特别适于各种霉菌优点：设备简单、操作方便，酶浓度高缺点：劳动强度大，原料利用率低，生产周期长,麸皮、米糠 酒曲、酱油曲 淀粉酶、蛋白酶,78,79,2.液体深层发酵液体深层发酵是在液体培养基中接种微生物，在一定的条件下进行发酵，生产得到所需的酶。适合于微生物细胞、植物细胞、动物细胞。优点：机械化程度较高，酶的产率较高，质量较稳定，产品回收率较高，是目前酶发酵生产的主要方式。缺点：技术管理较严格,80,81,谷氨酸发酵罐,82,葡萄酒发酵罐,83,3.固定化细胞发酵固定化细胞发酵是在固定化酶的基础上发展起来的发酵技术。固定化细胞是指固定在水不溶性的载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。优点：可提高产酶能力；发酵稳定性好，可以反复使用或连续使用较长的时间；利于连续化、自动化生产；利于产品分离纯化，提高产品质量。缺点：需要特殊的固定化细胞反应器，只适用胞外酶生产,84,Figure 2 Scanning electron micrograph of CHO cells immobilized on ImmobaSil FS macroporous microcarriers(scale bar,50mm),85,4.固定化原生质体发酵固定化原生质体是指固定在载体上、在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体。优点：解除细胞壁扩散阻碍；易于细胞间质中的酶的 分泌；可反复或连续使用缺点：制备复杂，维持较高的渗透压，需防止细胞壁再生,86,87,二、提高产酶量的措施,优良的产酶细胞正常的发酵工艺条件及调节控制有效措施添加诱导物控制阻遏物浓度添加表面活性剂添加产酶促进剂,88,1.添加诱导物能够使某些酶的生物合成开始或者加速的物质。（1）酶的作用底物乳糖-半乳糖苷酶，以乳糖代替葡萄糖，可以使-半乳糖苷酶表达量提高数千倍（2）酶的反应产物半乳糖醛酸（果胶酶水解产物）果胶酶（3）酶作用底物的类似物IPTG-半乳糖苷酶（IPTG的诱导效率比底物乳糖高几百倍）,89,酶的诱导物,90,2.控制阻遏物浓度能够引起某些酶的生物合成停止或者减速的物质。产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物引起的阻遏作用,91,（1）解除产物阻遏作用及时分离产物,控制产物浓度枯草杆菌碱性磷酸酶受其反应产物H3PO4 的阻遏，当培养基中H3PO4 含量在1.0 molmL-1 以上时，该酶的合成完全受阻；而当H3PO4 含量在0.01 molmL-1 以下时，该酶大量产生,92,（2）解除末端产物阻遏作用采用营养缺陷型，控制代谢产物添加量硫胺素缺陷型突变株发酵，限制硫胺素，可使硫胺素焦磷酸酶合成量提高1000多倍对于非营养缺陷型菌株，添加末端产物类似物。组氨酸合成：添加组氨酸类似物2-噻唑丙氨酸，即可以解除组氨酸的反馈阻遏作用，使组氨酸合成途径中10种酶的生物合成量提高30倍。,93,（3）解除分解代谢物阻遏作用控制速效性碳源（葡萄糖）的浓度改用迟效性碳源（淀粉）或补料、分次流加碳源添加cAMP,94,3.添加表面活性剂（surfactant）表面活性剂增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。有利于提高某些酶的稳定性和催化能力,利用木霉发酵生产纤维素酶时，在培养基中添加1%的吐温，可使纤维素酶的产量提高l20倍,95,4.添加产酶促进剂产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。植酸钙镁：霉菌蛋白酶或者橘青霉磷酸二酯酶提高120倍；聚乙烯醇（polyvinyl alcohol）：提高糖化酶的产量；聚乙烯醇、醋酸钠：对提高纤维素酶的产量要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。,96,三、酶发酵动力学,发酵动力学（fermentation kinetics）是研究发酵过程中细胞生长速度、产物生成速度、基质消耗速度以及环境因素对这些速度的影响规律等的学科。细胞生长动力学：细胞生长速率及影响因素产物生成动力学：产物生成速率及影响因素产酶动力学基质消耗动力学：基质消耗速率及影响因素,97,（一）酶生物合成的模式,细胞在一定条件下培养牛长其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期4个阶段,调整期 生长期 平衡期 衰退期,98,酶生物合成的模式(a)同步合成型(b)延续合成型(c)中期合成型(d)滞后合成型,99,1.同步合成型,酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式(生长偶联型)。,特点：(1)酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。(2)当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。,100,例如，米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶或称为鞣酸酶（tanase EC31120）。,细胞浓度mgmL-1,酶浓度UmL-1,0 20 40 60(h),101,2.延续合成型,酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。黑曲霉合成聚半乳糖醛酸酶,特点：（1）该类酶可受诱导，一般不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。（2）该酶对应的mRNA是相当稳定的。,102,滞后合成型,中期合成型,受到分解代谢物阻遏,103,3.中期合成型,是酶的生物合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止的一种合成模式。枯草杆菌合成碱性磷酸酶（受磷酸反馈抑制）,特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。所对应的mRNA是不稳定的。,104,4.滞后合成型,滞后合成型又称非生长偶联型，是酶的生物合成在细胞生长进入平衡期以后才开始并大量积累的一种合成模式。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。黑曲霉酸性蛋白酶（羟基蛋白酶）合成,特点：（1）该类酶受分解代谢物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。（2）该酶对应的mRNA稳定性高。,105,4.滞后合成型,0 4 8 12(h),黑曲霉酸性蛋白酶合成,0 4 8 12(h),酶浓度UmL-1,黑曲霉酸性蛋白酶合成,30,22,酶浓度UmL-1,不加放线菌素D,加放线菌素D,加放线菌素D,不加放线菌素D,106,总结：影响酶生物合成模式的主要因素,107,108,（二）细胞生长动力学(cell growth kinetics),细胞生长动力学主要研究细胞生长速率以及外界环境因素对细胞生长速率影响的规律。1950年，法国的莫诺德(Monod)首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程：细胞生长速率与细胞浓度成正比,Rx：生长速率，单位时间内细胞浓度的增加值，mg/mL.min，g/L.hX：细胞浓度，mg/mL，g/L（105烘干至恒重）：比生长速率，生长速率与细胞浓度之比（单位细胞在单位时间内浓度增加值），h-1t：时间，h，min,109,莫诺德生长动力学模型（growth kinetics model）,若培养基中只有一种限制性基质时，为此限制性基质浓度的函数：莫诺德方程（Monod equation）,S：限制性基质浓度，mol/L，g/Lm：最大比生长速率，限制性基质浓度过量时的比生长速率（special growth rate），即当S Ks时，=m Ks：Monod常数，比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度，即当=0.5m时，S=Ks,限制性基质：是指培养基的有关组分中惟一含量是限制性的基质，其他基质都是过量的。它是关键性的基质，细胞培养速率的决定因素，对发酵起决定性作用的基质成分，通常是碳源物质。,110,连续发酵的生长动力学方程,连续全混流反应器发酵过程中,稳态时游离细胞连续发酵的生长动力学方程:,D=0 时,分批发酵;D 时，dX/dt为负，细胞浓度下降,S,;D m 时，X趋于零，无法达到新的平衡,D：稀释率,是指单位时间内,流加的培养液与发酵容器中发酵液体积之比.一般以h-1为单位。例如，D=0.2,表明每小时流加的培养液体积为发酵容器中培养液体积的20%。,111,双倒数作图法求m与KS,Monod 方程与 Michaelis-Menten 方程比较,112,双倒数作图法求m与KS,通过实验，在不同限制性基质浓度S1，S2，Sn的条件下，分别测出其对应的比生长速率1，2，n，然后，以1/为纵坐标，1/S 为横坐标作图,即可得到m和Km。,113,（三）产酶动力学（enzyme production kinetics）,产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律。宏观产酶动力学（非结构动力学）从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率微观产酶动力学（结构动力学）从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率,114,宏观产酶动力学,产酶速率（RE）与细胞比生长速率（）、细胞浓度（X）等因素有关，即,X 细胞浓度（g DC/L）细胞比生长速率（1/h）生长偶联的比产酶系数（U/g DC）非生长偶联的比产酶速率（U/h g DC）E 酶浓度（U/L）t 时间（h）RE 产酶速率（U/hL）,115,116,（四）基质消耗动力学,研究发酵过程中基质消耗速率及影响因素基质包括碳源、氮源、氧气等发酵过程中，基质消耗通常用于细胞生长、产物生成和正常的新陈代谢，因此基质消耗速率（RS）表示为这三项之和，即由于发酵过程中基质不断被利用，浓度不断降低，因此，基质消耗速率为负值,117,（四）基质消耗动力学,研究发酵过程中基质消耗速率及影响因素基质包括碳源、氮源、氧气等发酵过程中，基质消耗通常用于细胞生长、产物生成和正常的新陈代谢，因此基质消耗速率（RS）表示为这三项之和，即由于发酵过程中基质不断被利用，浓度不断降低，因此，基质消耗速率为负值,S,S1 菌体增殖,S2 产物合成,S3 新陈代谢,118,（四）基质消耗动力学,研究发酵过程中基质消耗速率及影响因素,基质消耗通常用于细胞生长、产物生成和正常的新陈代谢，因此基质消耗速率（RS）表示为这三项之和，即,负值,119,1.用于细胞生长的基质消耗速率，表示单位时间内细胞生长所引起的基质浓度变化,t 时间（h）X 细胞浓度（g DC/L）细胞比生长速率（1/h）YX/S 细胞生长得率系数，指细胞浓度变化量（X，g/L）与基质浓度变化量（-S，g/L）之比,120,2.用于产物生成的基质消耗速率，表示单位时间内产物生成引起的基质浓度变化,其中，产物生成得率系数（YP/S）定义为产物浓度变化量（P，g/L）与基质浓度变化量（-S，g/L）之比,121,3.用于维持细胞代谢的基质消耗速率，表示单位时间内维持细胞正常新陈代谢所引起的基质浓度变化,细胞维持系数（m，h-1）定义为单位时间（t）内基质浓度变化量（-S，g/L）与细胞浓度（X，g/L）的比值细胞维持系数主要决定于微生物种类，也受外界条件的影响，也称细胞为此常数。,122,基质消耗动力学方程,123,酶发酵动力学小结实际发酵过程远比模型复杂，以上模型在使用时往往需要根据实际情况进行修正动力学模型参数的估算是一项重要而又复杂的问题，有时候通过实验数据拟合得到，有时候需通过大量实验数据分析并借助于经验公式估算在实验中，数据有时会呈现随机性和波动性，需要借助于数学方法和计算机编程解决,124,四、固定化微生物细胞发酵产酶,固定化细胞（immobilized cells）的概念固定化细胞是用各种方法固定在载体上，在一定空间范围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。又称固定化活细胞、固定化增殖细胞20世纪70年代后期(1978)发展起来的技术目前在发酵生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等胞外酶方面取得了成功,125,（一）固定化细跑发酵产酶的特点,产酶率提高细胞密度增大，生化反应加速，提高产酶率可以反复使用或连续使用较长时间细胞不易脱落流失稳定性好受载体保护，细胞适应性宽，能稳定发酵缩短发酵周期，提高设备利用率可预培养再转入发酵产品容易分离纯化细胞不溶于水，发酵液中游离细胞少适用于胞外酶等胞外产物的生产,126,（二）固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制,1固定化细胞的预培养利于固定在载体上的细胞生长繁殖。采用适合细胞生长的生长培养基和工艺条件。发酵时改换成适合产酶的发酵培养基和发酵工艺条件。在生长阶段和产酶阶段没有不同的要求，可采用相同的培养基和工艺条件。,127,2溶解氧的供给氧的供给成为主要的限制性因素。增加溶解氧的量的措施：加大通气量，但避免剧烈搅拌（气升式反应器）游离的枯草杆菌细胞发酵生产-淀粉酶，通气量0.51固定化枯草杆菌细胞发酵，其通气量则要求在12以上。改变固定化载体少用琼脂等对氧扩散不利的载体采用多孔材料或人工制孔，增强溶解氧在载体内的扩散添加能富集氧或有利于氧传递的物质降低培养基的浓度和黏度,128,3温度的控制适应范围较宽，分批发酵和半连续发酵过程中不难控制。连续发酵时，由于稀释率（D）较高，反应器内温度变化较大，因此应预先调节流加液温度,129,4培养基组分的控制从固定化细胞的结构稳定性和供氧的方面考虑控制影响固定化载体结构的物质采用海藻酸钙凝胶制备的固定化细胞，过量的磷酸盐会使其结构受到破坏应该限制磷酸盐的浓度添加一定浓度的钙离子增加溶解氧培养基的浓度不宜过高培养基的黏度应尽量低,130,（三）固定化细胞生长和产酶动力学,固定化细胞体系中的细胞固定化细胞，浓度基本稳定游离细胞,固定化细胞,游离细胞,酶活力,131,1固定化细胞生长动力学体系中的细胞包括固定化的和游离的，因此细胞生长速率与细胞浓度（X）和比生长速率（）正比，即得,132,根据 Monod 方程得到固定化细胞生长动力学方程,在以角叉菜胶为载体的固定化细胞生产-淀粉酶的研究结果表明，KSg 和 KSf 数值差别不大，而mg mf，说明固定在载体上的细胞的生长明显受到抑制,mg 固定在载体上的细胞的最大比生长速率mf 游离细胞的最大比生长速率KSg 固定在载体上的细胞的 Monod 常数KSf 游离细胞的