细胞融合与单克隆抗体.ppt
3.2.1 杂交瘤单克隆抗体技术的理论3.2.2 杂交瘤技术过程3.2.3 单克隆抗体的规模化生产3.2.4 单克隆抗体的改造和应用,3.2 单克隆抗体技术,免疫系统,由淋巴器官、组织、细胞共同构成。免疫器官：中枢免疫器官：骨髓、胸腺、（鸟、禽）法氏囊 外周免疫器官：淋巴结、脾、扁桃体等免疫细胞：造血干细胞、淋巴细胞（T、B、NK）、白细胞等。免疫分子：抗体、补体、细胞因子、干扰素等。,3.2 单克隆抗体技术,胸腺,骨髓,中枢淋巴器官,外周淋巴器官,扁桃体，淋巴结,淋巴结,脾,淋巴管,肠系膜淋巴结,T细胞和B细胞的分化,3.2 单克隆抗体技术,T细胞介导的免疫应答,一、抗原的识别与递呈（感应阶段）,二、反应阶段,三、效应阶段,四、细胞免疫的生物学效应,3.2 单克隆抗体技术,一、抗原的识别与递呈（感应阶段）,（一）APC对抗原的递呈（二）T细胞的双识别,3.2 单克隆抗体技术,抗原呈递细胞(antigen-presenting cell),一种特殊类型的细胞，携带细胞表面MHC（主要组织相容性复合体）II类分子，涉及抗原的加工和呈递给辅助T细胞。,3.2 单克隆抗体技术,3.2 单克隆抗体技术,T细胞活化的第一信号,二、反应阶段,由TCR 识别并结合抗原性多肽传递抗原信号；CD4、CD8分子分别识别MHC-II类和MHC-I类分子。,3.2 单克隆抗体技术,T细胞活化的第二信号,又称协同刺激信号，由众多协同刺激分子与相应受/配体结合介导，主要是B7/CD28分子对之间的作用。,3.2 单克隆抗体技术,T细胞在双信号的激发下，表达细胞因子及相应受体，进一步促进T细胞活化、增殖。若TCR特异性识别并结合抗原肽的过程中缺乏协同刺激信号，则T细胞被诱导呈不应答。,3.2 单克隆抗体技术,（三）T细胞的增殖和分化,CD4+TH 分化为：TH1 CD8+CTL（TC)分化为：有杀伤效应的CTL（TC),3.2 单克隆抗体技术,Tc杀伤细胞,3.2 单克隆抗体技术,细胞免疫应答,3.2 单克隆抗体技术,体液免疫应答,3.2 单克隆抗体技术,抗原：一类能够刺激动物机体的免疫系统，诱导发生免疫 应答，产生体液免疫的抗体和（或）细胞免疫的效 应淋巴细胞，并在体内外与之反应的物质。,3.2 单克隆抗体技术,能起抗原作用的各类物质必须具备如下特性：,(1)外源性 机体以往从未接触过的外源异物或异体；(2)结构性 分子量在10，000以上的大小，分子表面有稳定 的环状结构基团(而非线状基团)作为识别位点；(3)特异性 由于抗原有不同的决定簇，产生相应的抗体与 抗原间的反应是特异性的。,3.2 单克隆抗体技术,抗体：在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一 类糖蛋白,能与相应抗原特异的结合，产生各种 免疫效应（生理效应）的球蛋白。,3.2 单克隆抗体技术,抗体(Ig):（Immunoglobulin)抗体分类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE,抗体结构,3.2 单克隆抗体技术,抗体作用的机理,中和反应 聚集反应 沉淀反应 补体活化,3.2 单克隆抗体技术,每个B淋巴细胞只能产生一种针对它能够识别的特异性抗原决定簇的抗体，而由这一个细胞通过有丝分裂繁殖形成的细胞群称为“克隆”，由这一个克隆系产生的抗体称为单克隆抗体,3.2 单克隆抗体技术,单克隆抗体技术的基本理论,正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是Kohler和Milstein 于1975年将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。,3.2 单克隆抗体技术,Georges J.F.Kohler,Csar Milstein,3.2 单克隆抗体技术,单克隆抗体(monoclonal antibody),随着在研究上应用日益广泛，对抗体的数量和质量（专一性）要求越来越高数量多:传统的实验动物马,兔等免疫不方便 质量高:大动物免疫难以做到单克隆,3.2 单克隆抗体技术,3.2 单克隆抗体技术,单克隆抗体生产技术(杂交瘤技术),用细胞融合技术获得单克隆抗体综合了两方面优势：淋巴细胞肿瘤:能不断增殖，没有产生专一抗体能力。从脾脏得到淋巴细胞:能产生专一抗体，不能不断增殖。,3.2 单克隆抗体技术,杂交瘤技术的基本原理,利用细胞融合技术，将已免疫过的B细胞与骨髓瘤细胞融合，在由此形成的单个杂种细胞中，B细胞提供产生单一型抗体的遗传信息，瘤细胞提供连续增殖的遗传信息。因此这种杂种细胞既能产生抗体又能无限繁殖。,3.2 单克隆抗体技术,高度均一性：纯度很高的均一性抗体 高度专一性：只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应 大量产生及稳定性：杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖之传代,3.2.1.2 单克隆抗体的特性,3.2 单克隆抗体技术,3.2.1.3 亲本细胞的选择,骨髓瘤细胞：1.本身不能分泌抗体2.选择次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT-）或者胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）的骨髓瘤细胞,3.2 单克隆抗体技术,B淋巴细胞：1.经特定抗原免疫能产生目的抗体的动物淋巴细胞2.免疫动物种系要与骨髓瘤细胞系一致或有相近亲源关系,3.2 单克隆抗体技术,3.2.1.4 融合细胞的选择原理,1964年Litterlefield HAT培养基 HHypoanthine 次黄嘌呤 AAminopterin 氨基喋呤 TThymidine 胸腺嘧啶脱氧核苷,3.2 单克隆抗体技术,原理：,正常及普通癌细胞不但具有利用培养液中的谷氨酰胺和尿核苷单磷酸合成DNA的能力，而且当这条主要途径被氨基喋呤（A）阻断时，还具有利用培养液中现成的次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶脱氧核苷（T）在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的作用下，借此应急通路来合成DNA的能力。,3.2 单克隆抗体技术,细胞内DNA的生物合成途径,主要生物合成途径,应急通路,氨基喋呤A,次黄嘌呤,次黄嘌呤核苷酸,HGPRT+,TK+,胸腺嘧啶,胸腺嘧啶脱氧核苷酸,DNA,3.2 单克隆抗体技术,3.2.2 杂交瘤技术过程,免疫动物融合细胞的制备两种细胞杂交融合分装培养抗体检测杂交瘤细胞的克隆冻存及单克隆的大量生产,3.2 单克隆抗体技术,杂交瘤技术操作流程图解,一、免疫动物,目的：在细胞融合后获得尽可能多的分泌针对于该目标抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞.,特定目标抗原,动物,免疫,脾脏中B淋巴细胞,B淋巴细胞大量增殖,刺激,能分泌针对于该抗原的特异性抗体,3.2 单克隆抗体技术,常规免疫法脾内一次性免疫法短程免疫法体外免疫法,常用免疫方法：,稳妥；优势克隆,省时；省抗原,省时,操作繁琐,3.2 单克隆抗体技术,腹腔注射,静脉注射,皮下注射,免疫途径：,3.2 单克隆抗体技术,常规免疫法：,第1次免疫：抗原+弗氏完全佐剂,(皮下注射或静脉注射),(皮下注射),(皮下注射),(静脉注射),3.2 单克隆抗体技术,二.融合细胞的制备,脾淋巴细胞的制备：1.放血致死免疫的小鼠，无菌操作取脾脏，去胞膜；2.用RPMI-1640或DMEM培养液清洗后，放在盛10ml培养液的 平皿的双层铜网上；3.用注射器内玻璃管将脾淋巴细胞轻轻挤压到培养液中；4.计数后将细胞液装入加盖离心管置冰箱备用,3.2 单克隆抗体技术,骨髓瘤细胞的制备,1.主要源于P3-Nsl-Ag4等骨髓瘤细胞系2.选择形态好的骨髓瘤细胞，0.2%台盼蓝染液，计数3.1500rpm离心，弃上清液，加培养液清洗后再次离心注：在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键,3.2 单克隆抗体技术,三.两种细胞杂交融合,1.按4:1-10:1的比例将脾细胞与骨髓瘤细胞混匀于同一个离心管中；2.离心，弃上清液.3.置于是37水浴中，摇动离心管逐滴加入的50%PEG，1分钟内完成，水浴中继续摇动1-2分钟；4.沿管壁加入10ml培养液，混匀稀释 PEG，终止其诱导作用；1000rpm 迅速离心1分钟，弃上清液。,3.2 单克隆抗体技术,四.分装培养,1.离心后的混合细胞中加入HAT培养液，使浓度达到2*105个 细胞/0.1ml培养液2.按每孔0.1ml细胞稀释液加入96孔培养板中，加盖密封后置 5%CO2培养箱37培养3.次日检查有无污染，若正常，换液（HAT培养液），以后隔 日一换4.两周后改用HT培养液，换3-5次后改用D-15培养液培养未融 合的脾细胞和骨髓瘤细胞5-6天后逐渐死亡,3.2 单克隆抗体技术,融合后细胞在HAT培养基中存活情况脾细胞（HGPRT+,TK+,不能长期生长）骨髓瘤细胞（HGPRT-,TK-，不能生长）杂交瘤细胞（HGPRT+,TK+，能够生长）,3.2 单克隆抗体技术,筛选：免疫荧光 ELISA等,五.杂交瘤细胞的筛选和克隆化,3.2 单克隆抗体技术,克隆化：有限稀释法 软琼脂培养法,3.2 单克隆抗体技术,抗体检测,抗原结合法用125I放射性元素标记的抗原第二抗体法-酶联免疫吸附测定法（ELISA）荧光活化细胞分类器法,3.2 单克隆抗体技术,酶联免疫吸附法(ELISA),待检杂交瘤培养上清液,技术原理：,3.2 单克隆抗体技术,单克隆抗体的纯化 硫酸铵沉淀法 离子交换层析 A蛋白-Sepharose亲和层析,3.2 单克隆抗体技术,单克隆抗体的生产体内：BALB/c小鼠体内诱发含有单抗的腹水 体外：无血清培养基悬浮培养等,3.2 单克隆抗体技术,单克隆抗体的规模化生产,杂交瘤细胞直接植入动物体内：1.将106-107的单克隆杂交瘤细胞，由皮下植入同系或组织相容正常的小鼠的体内，约过两周后，在小鼠的皮下形成相应的移植性肿瘤，用这些肿瘤再去接种更多的小鼠。2.在肿瘤出现后的一段时期，通过多次采血得到含单克隆抗体的血清，每ml血清内约含1-10ml的抗体，但取血量有限。3.因此，可将相同数量的单克隆抗体细胞植入在3-10天前经腹腔注射0.5ml异十八烷或其它矿物油的初次致敏的小鼠腹腔内。在接种后的二周左右的时间内，经穿刺而得到5-10ml的腹水，内含单克隆抗体的浓度5-20mg/ml,3.2 单克隆抗体技术,现在的生物技术公司一般采用生物反应器悬浮培养的方法生产单克隆抗体。由于杂交瘤细胞的高密度生长，使得抗体效价可达到10100mg/ml。美国Damon公司的专利方法是将细胞培养在一种中空的微球体内，这种被称之为微囊的微球体外面由多孔膜包裹，使内部生长的杂交瘤细胞受到多层保护而不受环境影响。此种微囊技术生产的抗体可达0.1-1g/L。抗体的生产达到一定的规模。,3.2 单克隆抗体技术,影响因素分析,（一）污染（二）融合后杂交瘤不生长PEG有毒性或作用时间过长牛血清的质量差，用前未严格筛选骨髓瘤细胞污染了支原体HAT有问题（A过高或HT含量不足）,3.2 单克隆抗体技术,（三）杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A 抵抗细胞所致有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆 竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的 生长；也可能发生染色体丢失。,3.2 单克隆抗体技术,
