基因工程试验指导书.docx

基因工程实验指导书THE EXPERIMENTAL GUIDE FOR GENE ENGINEERING马月萍崔振波编写植物基因工程示意图东北大学理学院生物技术研究所二零零六年一月实验须知上好实验课是学好基因工程原理学的重要环节，它使同 学们在验证课堂上所学理论知识、加深理解教师讲授内容的 同时，还能使同学们得到基本实验技术、技巧的锻炼，为将 来从事生物学基因工程方面的研究打下一定基础，因此必须 予以足够的重视。为此，必须做到：一、实验前预习实验指导书并复习有关内容二、按实验指导及教师的要求进行观察，记载，写好实验 报告，字迹要整洁、清楚。三、爱护实验仪器、设备，注意节约药品和各种实验材料， 按操作规程使用仪器，严禁私自拆卸仪器及调整仪器 附件，如有损坏，照价赔偿。四、注意安全，严格遵守操作规程，如遇特殊情况应及时 报告指导教师。五、保持实验室安静，不得在实验室内喧哗，不得迟到和 早退，实验完毕将实验用品放回原来位置，各组轮流 打扫卫生。实验一质粒DNA的小量提取与纯化-1 -实验二限制性内切酶消化质粒DNA- 5-实验三感受态细胞的制备-7 -实验四 聚合酶链式反应（PCR）体外扩增质粒DNA- 11 -实验五大分子DNA的制备-15 -实验六Southern 杂交-19 -实验七RNA的制备及Northern杂交分析-25 -参考文献-32 -实验一质粒DNA的小量提取与纯化一实验目的1 .学习质粒DNA的制备原理。2. 掌握用碱变性抽提法提取与纯化质粒DNA操作技术。3. 掌握水平式琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA技术。二实验原理质粒是一类在细菌细胞内发现的，是存在于细胞质中的一类独立于染色体 外，能够自主复制的环形双链的DNA分子。质粒DNA可持续稳定地处于染色 体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色 体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒DNA编码的蛋白质往往 赋予寄主细胞一定的表型特征，如各种抗性质粒、降解性质粒、致病性质粒等。质粒DNA的提取与纯化是基因工程操作中常用的一项技术。质粒DNA的 制备方法很多，其中常用的是碱裂解法小量制备质粒DNA。一般它们包括三个 基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质*mNA的提取； 质粒DNA的纯化。1. 细菌的生长和质粒的扩增从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养， 对于高拷贝的质粒（pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培 养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA， 但对于拷贝数较低的质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培 养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。因为氯霉 素可以抑制寄主菌的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的复制，但是质粒则 仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续上升。2. 细菌的收集、裂解和质粒DNA提取细菌的收集可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采取多种方法，包括 用非离子型去污剂、有机溶剂或碱处理及加热处理等。质粒DNA提取的基本 原理是利用寄主菌（一般是大肠杆菌）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质 差异：（1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。（2）从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA是变性的线性分子，而大多数质 粒DNA是共价闭合的环状分子。（3）环状质粒DNA较细菌的基因组DNA耐碱性强，细菌裂解物用碱性 缓冲液处理后细菌的基因组DNA首先被裂解，通过离心与菌体碎片和各种蛋 白质一起沉淀下来，环状质粒DNA存在于上清液中。3.质粒DNA的纯化纯化质粒DNA的方法很多，通常使用的方法都是利用了质粒DNA相对较 小和共价闭合环状这两个基本性质。多年来，绿化艳-漠化乙锭剃度平衡离心一 直是制备大量质粒DNA的首选方法，然而该过程既昂贵又费时，为此发展了 许多代替方法，其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析，分级沉淀（聚 乙二醇和LiCl分级沉淀法）等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。对于小量 制备的质粒DNA，经过苯酚抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残 余蛋白质及RNA，达到纯化的目的。质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环形DNA （cccDNA, SC构型）、 开环DNA （OC构型）和线性分子（L构型）在细菌体内，质粒DNA是以负 超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管分 子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依 次是 L DNA 和 OC DNA。三实验器材、试剂及材料1 .实验器材超净工作台、台式离心机、微量加样器、恒温培养箱、恒温摇床、核酸电 泳仪、电泳槽、小型混合器、冰箱、试管、1.5ml离心管2. 实验试剂（1） LB培养基1L蛋白胨10g酵母浸膏5gNaCl10g固体加15g Agar，定容全1L后，高压火菌20分钟（2）溶液I50mmol/L葡萄糖25 mmol/LTris.Cl (pH8.0)10mmol/LEDTA (pH8.0)一次配制100ml,然后高压火菌15分钟。4°C保存。（3）溶液II （现用现配）0.2mol/LNaOH1%SDS（4）溶液III5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml双蒸水28.5ml配制好的溶液III含有3mol/L钾盐，5mol/L醋酸（pH4.8）（5）乙醇（6）RNA 酶（7） 50 x TAE 缓冲液：242g Tris-碱，57.1ml 冰醋酸，100ml 0.5M EDTA（pH8.0），定容至 1000ml,（用 时稀释为 1x）（8）0.8%琼脂糖（9）6x凝胶加样缓冲液:0.25%漠酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（w/v） 蔗糖水溶液。3. 实验材料大肠杆菌：Top10亚克隆载体：pUC19, 2.68kb四实验步骤1.碱法小量制备质粒DNA（1）挑取新鲜琼脂培养板上的单菌落，接种在3ml LB培养液中（含50gg/ml 氨苄青霉素），37°C振荡培养过夜。（2）取1-1.5ml培养液移到1.5ml离心管中，12000rpm离心1分钟，收集 菌体。（3）弃上清，将细菌沉淀悬浮于100gl冰预冷的溶液I中，强烈振荡混匀， 室温搁置5分钟。（4）加200gl溶液II，盖严管盖颠倒离心管几次以混合内容物，不要强烈 振荡，置冰上5分钟，使细胞膜完全裂解。（5）加150妇 溶液III，倒转几次混匀，冰上放置10分钟。此时酸中和 碱，质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不溶性复合物，同时 钾盐使游离SDS沉淀。（6）12000rpm离心5分钟，沉淀染色体DNA及不溶的变性蛋白，取上 清到一个新的离心管中。（7）上清液用等体积的Tris-HCl饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提 12 次。(8) 上清液用等体积的氯仿：异戊醇(24:1)抽提1次。(9) 上清液加2倍体积的无水乙醇，混匀后室温放置10分钟(10) 12000rpm离心10分钟得到质粒DNA沉淀。(11) 弃上清，加1ml 70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5分钟。(12) 弃上清，将管倒置放在滤纸上，待乙醇完全蒸发。(13) 加入30 UTE缓冲液或ddH2O，溶解DNA，加入 川1 RNaseA后混 匀，37°C 30分钟，消化小分子RNA。-20°C放置备用。2. 质粒DNA的快速电泳检测质粒DNA的浓度通常通过电泳来估算，取2ul质粒加入上样指示剂，进行 琼脂糖凝胶电泳分析3. 1%琼脂糖凝胶的配制(1) 加100ml TAE或TBE缓冲液于三角瓶中。(2) 称取1克琼脂糖，于微波炉中加热至完全熔化(3) 冷却至60C左右。(4) 加上漠化乙锭母液(100mg/ml)至终浓度为0.5ug/ml (5ul)，轻轻摇匀。注：漠化乙锭(EB)为剧毒物，操作请戴手套。(5) 轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。(6) 将胶板除去封胶带，加入电泳缓冲液(TAE或TBE)中，轻轻拔除梳子， 即可上样。五注意事项1. 菌体生长时，一般新复壮的菌落为34小时，保存的菌落常需要12小 时甚至更久，菌数不能太浓，因为衰老期的菌体其内源性DNase的释入，使得 不易提取质粒，但是菌体数太低质粒将太少。2. 菌液离心后，上清应除干净，以免影响后面的酶切。3. 抽提用的苯酚和氯仿不能残留，否则将影响酶切。4. 沉淀后，用乙醇洗涤操作要适当，既要洗尽盐又要防止质粒的流失过多。 六思考题1 .高拷贝的质粒为什么不需要在含抗性的培养基中进行选择培养？2. 如何将质粒DNA与寄主染色体DNA分离开？3. 质粒DNA分子有几种构型，在琼脂糖凝胶中迁移率如何分辨？4. 溶液II的作用是什么？5. DNA分子在电泳缓冲液中带正电荷还是负电荷，在电场中的移动方向如何？实验二限制性内切酶消化质粒DNA一实验目的1. 掌握限制性内切酶消化质粒DNA的原理及其操作方法。2. 进一步学习水平式琼脂糖凝胶电泳的操作方法。二实验原理限制性内切酶是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌细胞内 同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰 作用）。它们对DNA底物有相同的识别序列，但生物功能却相反。由于细胞内 存在DNA甲基化酶，它能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化，就避 免了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破坏，而对感染的外来噬菌体DNA， 因无甲基化而被切割破坏。所以限制性内切酶是该细菌细胞的卫士，它与DNA 甲基化酶一起构成了保护自己的、抵抗外源入侵的DNA的防御机制。如果入 侵的噬菌体DNA没有完全被限制性内切酶切割破坏，残留的噬菌体DNA在复 制时，由于DNA甲基化酶的存在，同样地也在识别部位进行修饰-甲基化。 限制性内切酶对这种复制后的噬菌体DNA就奈何不得，以至大量繁殖起来， 使受体细胞也因此遭到灭顶之灾。目前发现的限制性内切酶有数百种°EcoRI和HindIII都属于II型限制性内 切酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能 力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序 的DNA片段。EcoRI和HindIII的识别序列和切口是：EcoRI： Gl AATTCHindIII： Al AGCTTG，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。限制性内切酶对环 状质粒DNA有多少切口，就能产生多少个酶解片段，因此鉴定酶切后的片段 在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致 判断酶切片段大小的差别。质粒的加工需要工具酶，限制性内切酶是重要的工具酶之一。将质粒和外 源基因用限制性内切酶酶切，再经过退火DNA连接酶封闭切口，便可获得携 带外源基因的重组质粒。重组质粒可以转移到另一个生物细胞中去，进而复制、转录和表达外源基 因产物。这样通过基因工程可获得所需要各种蛋白质产物。实验二限制性内切酶消化质粒DNA三实验器材、试剂及材料1. 实验器材超净工作台、恒温水浴锅、台式离心机、微量加样器、核酸电泳仪、电泳 槽、紫外透射仪、冰箱、1.5ml离心管、一次性手套2. 实验试剂无菌H2O、10X酶切缓冲液、EcoRI限制性内切酶、电泳加样缓冲液、琼 脂糖、1XTAE缓冲液3. 实验材料：质粒 DNA (pUC19)四实验步骤1 .混合下列溶液于一个无菌的1.5ml离心管中，形成20gl的反应体系。无菌H2O14gl质粒DNA3gl10X酶切缓冲液2glEcoRI限制性内切酶1gl上述离心管内反应液混合均匀，然后置于37恒温水浴锅中温育2h。2. 从恒温水浴锅中取出装有反应液的离心管，加入4妇电泳加样缓冲液 终止反应，混匀。用0.8%水平式琼脂糖凝胶电泳和紫外透射仪鉴定酶切结果。五注意事项DNA制品中的污染(如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高盐浓 度)均能抑制酶切活性。这种抑制可通过增加酶作用单位数(10-20U/gg DNA)、 增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间来加以克服。六思考题1. 常用的限制性内切酶属于哪一类内切酶，切割能产生几种末端？2. 影响限制性内切酶的因素有哪些？如果一个DNA酶解液在电泳后发现 DNA未被切动，你认为可能是什么原因？3. 用双酶切时需要考虑哪些因素？不能用同一种缓冲液时，该如何进行酶 切？4. 琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？实验三感受态细胞的制备一实验目的1 .掌握感受态细胞的制备的原理和技术2.掌握转化的技术和方法二实验原理在克隆技术中，转化(transformation)特指以质粒DNA或以它为载体构 建的重组子导入细菌的过程。转染(transfection)是指噬菌体、病毒或以它作 为载体构建的重组子导入细胞的过程。对于以噬菌体为媒介，将外源DNA导 入细菌的过程，有人称之为转导(transduction)。转化这一概念来源于遗传学：细菌细胞吸收外源DNA发生可遗传的改变 叫转化。转化是一个自然存在的过程。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫 感受态。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细 菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内。这项技术始于 Mandel和Higa1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的CaCl2溶液处理及短 暂热休克后，容易被入噬菌体DNA感染。随后Cohn于1972年进一步证明质 粒DNA用同样的方法也能进入细菌。CaCl2转化法的基本原理是：细菌处于0°C，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨 胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基一钙磷酸复合物粘附于 细胞表面：经42C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物；在丰富培 养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中的外源基因 得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。在CaCl2转化法的基础上，人们逐渐探讨了其它化学转化法，如MgCl2、 CoCl2等。也有人对CaCl2转化法加以改进。另外电击转化法由于操作简便，转 化率较高而越来越为人们所接受。三实验器材、试剂及材料1. 实验器材无菌工作台，小型高速离心机，恒温摇床，恒温箱，-20C冰箱，恒温水浴 器，吸头，枪，试管，培养皿，1.5ml离心管2. 实验试剂LB液体培养基，LA液体培养基及LA琼脂平板，0.1mol / LCaCl2 (CaCl2 先配制成lmol / L，用0.22Mm的滤膜过滤后贮存，使用前稀释至0.1mol/L，并 用0.45pm的滤膜过滤后使用)。3. 实验材料大肠杆菌：Top10或DH5 a菌株，四 实验步骤(CaCl2转化法)1. 感受态细胞的制备(1) 宿主菌DH5a在LB培养基上划线，37°C培养1620小时。(2) 挑单菌落移至含3ml LB的试管中，37C强烈振荡培养过夜。(3) 第二天早测OD600值，经计算取出一定体积加入50ml LB中，使OD600 约为0.015。37C振荡培养大约三小时，测试OD600值至0.50.6，这时 细菌生长大约在对数生长期。(4) 将50ml培养基分至两个50ml离心管中，4C，4000rpm离心10分钟。(5) 除尽上清液。(6) 共加入17m1 (50ml的1/3倍)0.1M预冷的CaCl2 (可先用lml重 悬沉淀)。(7) 置于冰上30分钟。(8) 4C， 3000rpm 离心 10 分钟。(9) 去掉上清。(10) 加入2ml CaCl2重悬细菌沉淀，分装。(11) 可立即使用或保存于4C(不宜超过一周)，或加15%甘油于-70C 保存。2. 转化(1) 对于已构建成功的高浓度重组质粒，取50pl感受态细胞，加入0.5pl 重组质粒DNA；对于连接反应产物，一般加入35pl连接反应产物。(2) 置于冰上30分钟。(3) 于42C热激90秒，立即置于冰上，3-5分钟后补加LB液体(无抗 生素)800ul，于37C振荡培养大约1小时。(4)取(3)中转化菌适量(200pl)，涂布于LB平板(氨卞青霉素50ug/ml)。37C过夜培养，通过质粒DNA提取鉴定重组子。五注意事项1. CaCl2 浓度Ca2+浓度是影响转化的重要因素。随着CaCl2浓度的提高，转化效率提高， 在0.0750.1M时达到峰值，而超过0.1M效率反而下降。2. 感受态细胞的保存后冰浴法制备的感受态细胞保存时间为30分钟时，转化效率和常规法无显 著差异。感受态细胞在4°C保存的时间越长转化效率越高，3天左右达到峰值， 随后逐渐吓降，但两周之内使用均可。六思考题1. 什么叫感受态？2. 为什么使用对数生长期的菌体细胞制备感受态？3. 影响转化成功的因素有哪些？4. 在感受态细胞制备与转化过程中为什么始终需要冰浴环境？实验四 聚合酶链式反应（PCR）体外扩增质粒DNA实验I聚合酶链式反应（PCR）体外扩增质粒DNA一实验目的掌握聚合酶链式反应（PCR ）的原理及其操作方法。二实验原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是体外酶促合 成特异DNA片段的一种方法。典型的PCR反应由高温变性、低温退火和适温 延伸等三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅 速扩增。其主要步骤是将待扩增的DNA置于高温下使之解链；人工合成的两 个寡核苷酸引物在低温下分别在目的片段两侧与DNA两条链互补结合；DNA 聚合酶在72°C将单核苷酸从引物的3端开始掺入，沿模板从5向3方向延 伸，合成DNA的新互补链。PCR技术能在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的某一特定 的目的DNA片段扩增106倍以上，而无需经过烦琐的基因克隆程序便可获得足 够数量的精确的DNA拷贝。它操作简单，易于掌握，结果也较为可靠，为基 因的分析和研究提供了一种强有力的手段，对整个生命科学的研究与发展都有 深远的影响。因此，得到广泛应用。可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分 析、突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性分析、遗传病 和传染病的诊断、肿瘤机制的探索及法医鉴定等诸多方面。PCR技术在分子克 隆和DNA分析中有着如下多种用途：1 .制备双链DNA中的特异序列作为探针；2. 由少量mRNA制备cDNA文库；3. 由cDNA克隆某些基因；4. 制备大量DNA以进行序列测定；5. 突变的分析；6. 染色体步移；7. RAPD、AFLP、RFLP、等 DNA 多态性分析。PCR反应体系应具备以下原料：DNA模板、寡核苷酸DNA引物、热稳定 的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、反应缓冲液，脱氧核苷三磷酸底物dNTP 等五部分组成，缺一不可：单双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA, 一般 须先通过逆转录得到第一链cDNA。虽然PCR可以仅用极微量的样品，但为了 保证反应的特异性，一般还宜用Ag水平的染色体DNA或104拷贝的待扩增片 段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之 后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA抑制剂以及能结合DNA 的蛋白，将可能干扰PCR反应。2. 引物：引物是决定PCR结果的关键因素，下列原则有助于引物的合理 设计：(1) 引物的长度以1530bp为宜，其Tm = 4 (G+C) +2 (A+T)，一般(G+C) 的含量在4555%，应尽量避免数个嘌吟或嘧啶的连续排列(尽量避免有三个 以上连续相同的碱基)，碱基的分布应是随机的。(2) 两个引物在3端不应出现同源性，避免引物形成内部二级结构，3 端的末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率，研究表明选T，G，C 为最好。(3) 人工合成的寡聚核苷酸引物最好经过PAGE或离子交换HPLC进行 纯化。(4) 引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端，一是容易形成引物二聚体 (primer-dimer),二是当扩增微量靶目标并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异产物。一般来说，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性比较好，一 般用0.250.5pmol/pl较好。(5) 新订的引物来了以后，在未开盖前稍加离心，然后用TE配成较高浓 度的母液(约100gM)，保存于-20°C。取出其中一部分用ddH2O配制成10pM 或20gM的工作液。3. Taq酶的用量在100gl反应液中，一般加入2.5U的酶量，足以达到每分钟延伸10004000 个核苷酸的掺入速度。酶量过多导致产生非特异性产物。但是不同的公司或不 同批次的产品常有很大的不同。由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当 进行预实验。一般100pl反应混合物用24U酶较为合适。4. 反应缓冲液用于PCR的标准缓冲液含：50mM KCl,10mM HCl (pH8.3,室温)和1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有显著影响。浓度过高，反应特异 性降低，浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200MM时，Mg2+为 1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。实验四 聚合酶链式反应（PCR）体外扩增质粒DNA在高浓度DNA及dNTPs条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度，一 般以1.52mM （终浓度）较好。5. dNTP的浓度高浓度dNTP易产生错误掺入；而浓度过低，则降低反应产物的产量°PCR 常用终浓度为50400pM的dNTPs。四种脱氧三磷酸单核苷酸的浓度应相同。 如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时，就会诱发聚合酶的错误掺入 作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTPs能与Mg2+结合，使游 离的Mg2+浓度降低。因此，dNTPs的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+ 浓度。三实验器材、试剂及材料1. 实验器材TC-512 PCR仪、超净工作台、台式离心机、微量加样器、核酸电泳仪、电 泳槽、冰箱、紫外透射仪、0.2ml离心管、一次性手套2. 实验试剂dNTP、Taq酶、模板质粒DNA、引物、10XPCR缓冲液、无菌H2O、电 泳加样缓冲液、琼脂糖、1XTAE缓冲液四实验步骤1.在0.2ml离心管依次加入下'列反应产物：样品对照无菌H2O15.0gl16.0pl10XPCR缓冲液2gl2 pldNTP(10mM each)0.5gl0.5pl引物(10|iM)0.5 pl0.5 pl引物(10|iM)0.5 pl0.5 pl模板质粒DNA1.0pl0.0plTaq酶0.5 pl0.5 pl总计20.0pl20.0pl将上述试剂在微量离心管中仔细混匀，尽量避免产生气泡。置于离心机上迅速离心片刻。2. 在PCR仪上设定以下程序:94°C变性5min，1个循环实验四 聚合酶链式反应（PCR）体外扩增质粒DNA94°C变性 1min； 55°C退火 1min； 72°C延伸 1min； 30 个循环72°C延伸10min, 1个循环3. 将样品置于PCR仪上进行扩增4. 用08%水平式琼脂糖凝胶电泳和紫外透射仪鉴定PCR结果。五注意事项1. PCR反应应该在一个没有DNA的干净环境中进行2. 所用的所有溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染。3. 所有PCR试剂中使用的水都应该用新鲜蒸馏的去离子水高压灭菌后分 装备用。4. 所有试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和离心管，玻 璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。5. PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。6. 扩增反应应设不加模板的阴性对照。六思考题1. PCR反应体系中包括哪些成分？2. 设计引物时应遵循哪些原则？3 .可以采取哪些方法来提高PCR扩增产物的特异性？4. PCR技术的应用范围？实验五 大分子DNA的制备实验五大分子DNA的制备一实验目的掌握植物DNA提取的基本步骤二基本原理一般生物基因组DNA组107-8bp,制备基因组DNA是研究基因结构和功能 的重要步骤，如大分子量DNA用于构建基因文库或基因组Southern分析，通 常要求得到片断的分子量为100200kb;如用于构建柯斯（cosmid）质粒文库， 还需要更大的DNA。而制备人工染色体，如细菌人工染色体文库（bacteria artificial chromosome,BAC）和酵母人工染色体文库（yeast artificial chromosome,YAC），就必须得到平均数百万碱基对大小的片段，以便用限制性 内切酶部分酶切后得到平均大小为200500kb的片段。通常要求大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端 多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克 隆工作。有效制备大分子DNA的方法都要考虑两个原则：（1）防止和抑制内源 DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。几乎所 有DNase都需要Mg2+或Mn2+为辅助因子，故实现（1）的要求，只需加入一定 浓度的螯合剂，如EDTA，柠檬酸，通常10100Mm （视材料）。为实现（2） 则当DNA处于溶解状态时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作一定要轻柔，在进 行DNA溶液转移时用大口（或剪口）吸管。下面所介绍的方法，是一种通用的方法。特别适合于难于破碎和材料中蛋 白含量高的情形；并且有以下几个优点：（1）在液氮冷冻条件下研磨破碎，保 证材料在此过程中各种DNase无法活动。（2）破碎过程中DNA存在于细胞核 中且呈固态，不受液体剪切力作用，既是细胞核破碎，导致断裂的程度也远低 于通常的要求（即大于等于200kb）。（3）由于对组织破碎程度可以很高且均匀， 故当加入含螯合剂的提取液后，DNase所需要的Mg2+等尚未开始作用已被鳌合 剂掩盖。（4）加入的去污剂一方面可以破坏细胞膜，使大分子DNA释放到提 取缓冲液中，另一方面也可以保护DNA受内源核酸酶的降解。植物材料由于DNase水平低，蛋白含量也低，其操作要点是要避免植物次 生代谢物质（如多酶，类黄酮等），植物多糖与DNA的共存，以保证DNA实 现正常酶切等操作。针对这些特点，CTAB法可有较好的结果。实验五 大分子DNA的制备三实验器材、试剂及材料1. 实验仪器高速冷冻离心机；恒温水浴；紫外可见光分光光度计；核酸电泳设备。剪口枪头；1.5ml Eppendorf 管2. 实验试剂A. 2 x CTAB buffer： 2g/100ml CTAB, 1.4mol/L NaCl, 20mmol/L EDTA, 100mmol/L Tris Cl (pH8.0)终浓度+试剂母液浓度50 ml100 ml150 ml200 ml2% CTAB/1 g2 g3 g4 g100mM Tris (pH 8.0)1M5ml10ml15ml20ml20mM EDTA (pH 8.0)0.5 M2ml4ml6ml8ml1.4MNaCl/4.095g8.190 g12.285g16.380gB . TE: (10mmol/L Tris,1mmol/LEDTA)( pH8.0 )：1ml pH8.0 的1mol/LTris - Cl缓冲液与0.2ml pH8.0的0.5mol/L EDTA溶液混合后，用重蒸水 定容100ml而成。药品名称1000ml100ml1M Tris (pH 8.0)10ml1ml0. 5M EDTA (pH 8.0)2ml0.2mlC. 0-MeD .氯仿/异戊醇：将氯仿与异戊醇24 : 1 (v/v)E. 异丙醇F. 70%乙醇G. RNase AH. 无水乙醇J. 3M乙酸钠3. 实验材料油松针叶四实验步骤实验五 大分子DNA的制备1. 水浴（65°C ）加热 CTAB buffer。2. 取植物叶片，称重。3. 将叶片置于研钵中，加入液氮，充分研磨至粉末状后，转移到50ml离 心管中。4. 在管中加入 65C 的 CTAB buffer （1g： 15ml）和 2%V 的8 -Me，与粉 末充分混匀（关键）。5. 65C水浴保温一小时以上，中间温和混匀几次。6. 待混合物冷却至室温后，加入等体积的氯仿，颠倒混和10min左右。7. 室温下5000g （或8000r）离心10min，取上清。8 .再加氯仿/异戊醇抽提一次。9. 直到蛋白层不明显时，取上清，加2/3 V的异丙醇。10. 有线状沉淀则挑出，无则离心。11. 用2ml 70%乙醇10000g （14000r）离心洗涤以去除盐（可置20 C冰 箱过夜）。12. 倒去70%乙醇，37C干燥（20min），溶于600 U TE缓冲液，转移至 1.5ml Eppendorf 管中。13. 加入 5p lRNase A （10mg/ml），37C保温 30min （可在-20 C冰箱中 过夜）。14. 用等体积氯仿/异戊醇（24:1）抽提13次（视材料等情况而定）。15. 离心（10000 rpm，5 min，室温），吸取上清。16. 上清中加入1/10 V 3M NaAc （终浓度0.10.4M），加入2倍体积无水 乙醇，室温放置1020min后，离心（10000rpm，5min），沉淀DNA。17. 沉淀用70%乙醇（-20 C）洗涤2 3次，37C保温箱中干燥后， 溶于适量TE buffer中。18. 测定DNA溶液在260nm和280nm光吸收值，计算OD260/OD280此 值应大于1.7如果小于1.7,则说明含较多的蛋白。OD260/OD235应大于1.7，小 于时含有小分子杂质。得率计算：1 OD260DNA为50ug/ml，因此公式为：OD260 X 50 X溶解体 积/组织鲜重19. 检测：0.8%琼脂糖凝胶进行恒压电泳（电压5V/cm）五注意事项基本注意事项见“基本原理”六思考题实验五 大分子DNA的制备1. 如何检测和保证DNA的质量？2. 为什么构建DNA文库时一定要用大分子DNA?3. 基因组凝胶电泳时琼脂糖浓度一般为多少，为什么？4. 提取缓冲液中8-巯基乙醇的作用是什么？实验六 Southern杂交一实验目的1. 掌握Southern杂交的技术原理。2. 掌握探针的制备技术3. 掌握Southern杂交的基本操作步骤二实验原理Southern杂交又称DNA印记杂交，是指利用毛细管作用，将变性DNA从 凝胶上转移至硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，加以固定后用探针杂交的技术。此 法是由Dr,Southern1975年建立的，通过对特异性探针结合的基因组DNA片段内 或其周围序列进行限制性内切酶酶切位点作图来研究基因在基因组内部是如何 组织排列的。它是分子生物学研究领域中最常用的技术之一，为后来发展的各 种生物大分子杂交技术提供了重要的理论和实践基础。1. 基本原理分子杂交技术是根据二条单链DNA（或DNA与RNA）中互补碱基序列能 专一配对的原理进行的。在一定条件下，单链DNA或RNA能与另一条单链 DNA互补的碱基形成氢键，从而使两条单链杂交成双链DNA分子。Southern印记杂交技术是由：电泳，印迹，固定和检测4个步骤组成。即 用一种或几种限制性内切酶消化DNA分子，通过琼脂糖凝胶按分子量大小分 离所得片段，随后使DNA在原位发生变性，并从凝胶中转移至一固相支持物 的过程中，各个DNA片段的相对位置保持不变，用放射性标记或非放射性标 记的DNA或RNA探针与固定于膜上的DNA分子进行杂交，经放射自显影或 显色反应确定所有与探针杂交的片段的位置。Southern杂交对样品的要求用于Southern杂交的植物DNA样品在纯度、长度、及浓度上均应达到一 定的要求。纯度上应无蛋白质、RNA、多糖及抑制限制性酶切的杂质，如酚类 物质、丹宁、类萜、色素等，并无提取时所用试剂如酚及盐离子的残留。在长 度上不应低于50kb,浓度应在0.5lug/以之间。探针很难直接与琼脂糖中的DNA进行杂交，因此必须把DNA转移至一固 相支持物中，DNA在高盐存在下可以通过毛细作用印迹到膜上（目前又发展了 真空转移和电转移等技术）。DNA片段的大小对转移效率有很大影响，大的 DNA片段较难定量转移，一般可以用短波长紫外照射凝胶，将其中的DNA断实验六Southern杂交裂为较小的片段，以利转移。实验表明，单链DNA的平均长度在大约1000个 碱基时即可充分转移。能产生可检测杂交信号所需的DNA量取决于几个因素：DNA中与探针互 补部分所占比例，探针大小与比活，膜上DNA的量。在最佳条件下经放射自 显影曝光数天后这一方法的灵敏度足以检出不到0.1pg的与高比活32P标记的探 针（109cpm/pg）互补的DNA。Southern印迹杂交方法通常需要10gg基因组 DNA。杂交所用探针一般多采用放射性同位素标记，但由于非放射性探针标记对 人体无害，无同位素污染及其后处理等优点，此外，标记的探针可长期保存， 随时可用，所以非放射性探针标记越来越受到重视。非放射性地高辛标记技术是指利用地高辛（digoxigenin,DIG）（一种半抗原） 标记DNA、RNA或寡聚核甘酸探针，以便进行杂交及随后的显色或化学发光 检测。非放射性探针标记方法之一是采用由间臂连接有类固醇半抗原的异羟基泽 地黄毒甘配基标记的dUTP （缩写DIG-dUTP）作为DNA合成的底物，经随机 引物标记法掺入新合成的DNA中，形成非放射性同位素标记探针，杂交后， 用相应的碱性磷酸酶联抗体检测DIG标记DNA的存在。在X-磷酸盐和消基蓝 四唑盐（NBT）存在下，碱性磷酸酶催化生色反应，显示出所检测的目标人 所在。对DNA标记来说，DIG通过一个不耐碱的酯键与dUTP相连。使用不耐 碱的DIG-11-dUTP可以更容易和有效地除去膜上的探针，利用第二种DIG标 记的探针进行再杂交，不耐碱的 DIG-11-dUTP标记的DNA探针不能用碱 （NaOH）变性，必须在沸水中保温变性。DNA标记:DIG-High Prime系统是以随