细胞拆合与重组.ppt
4.6 动物细胞核移植,4.6.1 克隆的概念4.6.2 鱼类、两栖类的细胞核移植4.6.3 哺乳类的细胞核移植4.6.4 克隆技术的应用与意义4.6.5 正确看待克隆技术4.6.6 克隆动物的现状和发展趋势,4.6.1 克 隆,Clone:指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。在不发生突变的情况下，它们应该有相同的遗传结构。,Cloning:通过克隆方式生产克隆群体的过程或手段。,克隆技术，无性繁殖的操作过程（动词）,无性繁殖群体（名词）,含义外延,无性繁殖的（产物）（形容词）,4.6 动物细胞核移植,1997年3月，世界卫生组织 克隆遗传上同一机体或细胞系（株）的无性生殖。,DNA分子、基因片断、单克隆抗体的复制也认为是克隆。,4.6 动物细胞核移植,全能性(Totipotency),细胞全能性,指已经分化了的和尚未分化的细胞具有发育成完整有机体的各种组织的潜在能力的性质。,4.6 动物细胞核移植,分化细胞之全能性,已分化细胞的细胞核，仍能像胚胎细胞般，含有引导生物完全发育的所有遗传讯息。分化细胞之全能性该如何重新启动？,4.6 动物细胞核移植,4.6.2 鱼类、两栖类的细胞核移植,1952年，美，Robert Briggs 和 利用两栖类卵细胞建立细胞核移植技术,Robert Briggs,4.6 动物细胞核移植,1955 豹蛙(Rana pipiens),4.6 动物细胞核移植,1958-1962年，英,John Gurdon和Machineer 爪蟾小肠上皮细胞核移植到未受精 的卵细胞中，培养出可育的爪蟾,4.6 动物细胞核移植,4.6 动物细胞核移植,4.6 动物细胞核移植,1970年,John Gurdon 用青蛙作材料脚蹼角质化细胞进行细胞核移植试验，蛙卵发育成了蝌蚪,4.6 动物细胞核移植,4.6 动物细胞核移植,中国鱼类、两栖类动物克隆历史,1961年，金鱼和镑铍鱼，鱼类不同亚科间的细胞核移植,童第周,1978年，黑斑蛙成体红细 胞的细胞核移入去核的未受 精卵中，发育成正常的蝌蚪,4.6 动物细胞核移植,1978 黑斑蛙(童第周),4.6 动物细胞核移植,1979年，中国科学院武汉水生生物研究所,两尾幼鱼,鲫鱼囊胚期细胞,385天59代连续传代培养,细胞核,同种鲫鱼的未受精卵,4.6 动物细胞核移植,1989年，童第周、牛满江,鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵 实现了不同种间的核质杂交。培育出草鱼核+团头鱼质的杂种鱼,4.6 动物细胞核移植,4.6.3 哺乳类的细胞核移植,艰难曲折过程卵细胞体积小 鼠80m 兔125m 牛140 m 人100 m,4.6 动物细胞核移植,显微操作仪（micromanipulator),4.6 动物细胞核移植,1977年，美国，杰克逊实验室,“亚无性繁殖”单亲小鼠,卵细胞受精,精卵核融合前，去精核,双核卵细胞,双核融合，细胞分裂,胚胎移入母鼠子宫,7只单亲小鼠,4.6 动物细胞核移植,1981年，Illmensee和Hoppy,首次小鼠卵移核实验成功,4.6 动物细胞核移植,Illmensee&Hoppe的克隆小鼠实验,4.6 动物细胞核移植,将核注入已去核的受精卵中,在培养皿中培养至细胞团,植入假母子宫,产出小鼠,核移植小鼠（克隆小鼠）,长成成鼠，呈核供体小鼠性状,克隆小鼠实验步骤,供体胚胎细胞核的制备受体受精卵的制备细胞核移植克隆鼠的培养,4.6 动物细胞核移植,A.供核胚胎的制备,取纯系灰色小鼠作核供体亲鼠，正常交配妊娠第4天，从雌鼠中收集胚泡，去透明带，使内细胞团与滋养层分离；将内细胞团和滋养层细胞分散成单个细胞。采用妊娠第4天的小白鼠胚胞，放入加有5ugml的脱氧核糖核酸酶，1O毫克分子的N-2羟乙基对二氮己烷-N-2乙烷磺酸，10牛胎儿血清Darbeco改良Eagle氏液(DMEM)培养，除去透明带，甩针分离营养细胞和内细胞团的细胞体，将这些细胞分离，再将分离的细胞移到加有10牛胎儿血清(DMEM)液中培养，保存在含有细胞松驰素B培养液中待用。,4.6 动物细胞核移植,B.受体受精卵的制备,从C57BL/6品系的黑色小鼠中收集受精卵核移植的卵子从输卵管壶腹部采取受精卵，放入加有1毫克毫升的牛睾丸玻璃酸酶Whitten氏培养液内，经5-10min除去卵丘层细胞，再放进加有5ug/ml的细胞松驰素B的Whitten石腊培养液中培养1h，待用,4.6 动物细胞核移植,C.细胞核移植,用8m的微玻璃吸管插入受精卵将原来的雌、雄核两核吸出用微细管插入胚胎单细胞中把核吸出，然后移入刚刚受精的黑色纯系核受体亲鼠受精卵这些核移植卵在新的whitten氏液内培养4-5d，发育到桑椹期或胚泡初期,4.6 动物细胞核移植,D.克隆鼠的培养,植入ICR品系的白色假孕小鼠子宫内着床发育产下仔鼠（全部与CBA/HT-6一样的灰色小鼠）同功酶电泳分析，新生仔鼠具有供核个体的遗传性状，而不持有供体细胞质的个体（黑色）或作为寄母的假孕（白色）的遗传性状,4.6 动物细胞核移植,1983年，Mcgrath和Solter首次利用显微操作技术和细胞融合技术，将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植，得到了产仔，并建立了重复性很高的核移植程序，使得核移植效率大大提高。Cheong等（1993）发现细胞周期早期的胚胎细胞核在受体细胞质中可以发生发育程序的重排，核移植胚胎的发育率明显提高。有研究表明，小鼠囊胚期的滋养层细胞与ICM细胞一样具有发育的全能性（Tsunda Sotomaru et al.,1999）。,4.6 动物细胞核移植,哺乳动物克隆方法,胚胎分割胚胎细胞核移植胚胎干细胞核移植胎儿成纤维细胞核移植体细胞核移植胚胎嵌合,4.6 动物细胞核移植,胚胎分割,未着床早期胚胎，分割多等份,胚胎分割次数越多，所含细胞数越少，发育成个体的能力越差,技术成熟，成功率高,4.6 动物细胞核移植,胚胎细胞核移植,未着床早期胚胎,单个细胞,去核未受精卵母细胞,融合,发育成胚胎,移入受体,4.6 动物细胞核移植,胚胎干细胞核移植,胚胎干细胞系具细胞全能性,结合细胞核移植技术,4.6 动物细胞核移植,胎儿成纤维细胞核移植,1996年，英，用此法克隆出3只山羊,4.6 动物细胞核移植,体细胞核移植,1997年2月，英，爱丁堡罗斯林研究所，伊恩维尔穆特,多利,4.6 动物细胞核移植,多利羊（Dolly)风暴,1997227 Nature 385：810813 多利羊1996.7 出生1996.11 收到文章1997.2 文章发表,4.6 动物细胞核移植,多利羊成为明星,4.6 动物细胞核移植,多莉与它的假母,4.6 动物细胞核移植,4.6 动物细胞核移植,4.6 动物细胞核移植,4.6 动物细胞核移植,4.6 动物细胞核移植,4.6 动物细胞核移植,4.6 动物细胞核移植,4.6 动物细胞核移植,克隆“多利”成功,解决了用体细胞做核供体与转基因的问题,4.6 动物细胞核移植,解决了使核供体细胞与核受体细胞（去核卵细胞）同步的方法。,研究发现：在供体核植入受体胞质后，不管是供体还是受体，处在分裂中期时更容易恢复全能性，原因可能有两个,4.6 动物细胞核移植,1、如果供体核处于分裂中期，则供体核由于核膜的缺失，使得受体的调控因子更容易与供体核发生接触而发生作 用。,4.6 动物细胞核移植,2、如果受体处于分裂中期，则受体存在许多因子可以使得 供体核的核膜消失，从而调控更容易其作用，全能性更 容易恢复,4.6 动物细胞核移植,“多利”的生物学意义,证明一个已经完全分化的动物体细胞仍然保持着胚胎 细胞的全部遗传信息,可以按照人的意志去改造、生产物种。,利用克隆技术复制哺乳动物的技术障碍已被突破，在理论上已成为可能。,4.6 动物细胞核移植,1998年7月，美国，夏威夷大学 Ryuzo Yanagimachi复制了五十几双不同世代的老鼠,The Honolulu Technique,4.6 动物细胞核移植,胚胎成功发育的关键,染色体套数是否能维持正常 胚胎发育过程中正确的基因表現调节 卵细胞和细胞核供应者两方的细胞周期阶段 两方之间的活动是否能互相配合,4.6 动物细胞核移植,4.6 动物细胞核移植,4.6 动物细胞核移植,1997年5月，Wilmut等 人类血液凝结因子成功的选殖到两只复制羊，Molly及Polly。,4.6 动物细胞核移植,多利和它的三个孩子,4.6 动物细胞核移植,尚未弄清的疑惑,已分化细胞的 DNA，如何能够被逆转回最初的受精卵时期的状态？它的机制是什么？细胞周期的相配与核移植实验成功之间，真正的连接机制又是如何？复制羊（cloned sheep）的成功并不代表所有的哺乳类都可能援用同样方式,4.6 动物细胞核移植,4.6.4 克隆技术的应用与意义,检验动物细胞全能性 加速动物繁殖、优良育种、保护珍贵动物 医药领域（模拟疾病、基因治疗、器官移植等）,4.6 动物细胞核移植,（1）技术尚不成熟 成功率低 夭折率高,4.6.5 正确看待克隆技术,4.6 动物细胞核移植,几个影响因素,1、营养过多发育过快，克隆动物一般都有发育过快的问题，体外培养的时间过长或培养液的成分可能与克隆动物的 流产以及出生后不久死亡有关,4.6 动物细胞核移植,2、线粒体问题 目前还不知道原本就存在于卵子里的线粒体到底在多大 程度上与个体的性质有关，细胞核的遗传基因与线粒体 的遗传基因相互影响的问题必须引起重视。,4.6 动物细胞核移植,3、核的重新编程不完整，染色体倍数不正确、性别等都可 能对克隆动物的质量产生影响，因为目前所得到的体细 胞克隆动物大多为雌性，因此性别可能对体细胞克隆的 成功率一定的影响。,4.6 动物细胞核移植,（2）克隆动物体细胞突变、寿命及其他遗传问题,体细胞分裂越多，发生突变的可能性越大无遗传物质的交流与互补寿命是否受体细胞分裂代数影响,4.6 动物细胞核移植,（3）是否是完全的复制,影响克隆动物遗传性状的因素：细胞突变受体卵细胞的细胞膜与细胞质的差异受体遗传上或生理上的差异后期生长的环境与驯化,4.6 动物细胞核移植,克隆动物可应用性的思考,4.6 动物细胞核移植,社会学和伦理学问题,4.6 动物细胞核移植,4.6.6 克隆动物的现状和发展趋势,动物克隆技术现状与不足 希尔，克隆羊端粒比同龄羊短 雷纳，体细胞核移植可能影响克隆动物免疫系统的发育,4.6 动物细胞核移植,动物克隆存活率低、发育异常原因,缺乏理论支撑：基因组重新编程机制尚不清楚动物克隆种属及细胞差异动物克隆技术条件的优化还未解决,4.6 动物细胞核移植,
