免疫实验2.ppt
酶联免疫吸附试验Enzyme-Linked Immunosorbent Assays(ELISA),免疫标记技术（immunolabelling technique）:是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。,免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA),用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。,一、原理 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种固相酶免疫测定的方法，目前广泛应用于各种抗原和抗体的检测。其基本原理是：将抗原或抗体固定在固相载体表面，并保持其免疫活性，再与酶标记抗体或抗原联结，并保持并保留酶的活性，然后加入酶反应的底物，后者被酶催化变为有色产物，反应颜色的深浅可与相应抗原或抗体的量相关。在本实验中，以辣根过氧化物酶标记抗人IgG抗体，与相应抗原IgG结合，标记的酶可催化底物（邻苯二胺）起显色反应，从而指示特异性抗原抗体反应的存在。,二、材料：1、人IgG包被的微量酶标反应板，（1：1万，1：2万，1：4万，1：8万，1：16万）2、酶标抗人IgG抗体稀释液、洗涤液（PH7.4，0.01MPBS-Tween20）、底物溶液，3、微量移液器、移液头、吸水纸、洗瓶、湿盒、37恒温箱等。,三、方法：1.人IgG包被微量酶标反应板：取人IgG各100ul，分别加入第1至5孔，设第6孔为对照。置37恒温箱2小时，取出，移入4冰箱过夜。取出，用洗涤液洗3次，5分钟/次。(略）2.用含小牛血清（BSA）的PH7.4PBS封闭，置37恒温箱，30分钟，取出。用洗涤液洗3次，35分钟/次。（略）3.用微量移液器吸取100ul酶标抗人IgG抗体，分别加入第6至1孔。置湿盒中，于37恒温箱中孵育30分钟。4.取出酶标板，用洗涤液洗3次，35分钟/次。5.按第6孔至第1孔的顺序，每孔各加100ul的底物溶液，置37恒温箱中10-15分钟。6.观察显色反应。,用PBS洗涤3次（将洗板液加入每孔，3min后倾去），以洗去未结合的游离酶标抗体。,不同浓度IgG100ul/孔,酶标板,1,2,6,5,4,3,酶标抗人IgG抗体,底物,观察显色,四、结果,1,6,5,4,3,2,15孔，随着包被抗原浓度降低，颜色逐渐变淡6孔（对照）无色,五、结论 ELISA可简便、快速、定量地检测抗原或抗体,操作注意事项：1、正确掌握微量移液器的使用方法：一档取样，二档加样。2、正确洗涤酶标板：勿使洗涤液溢出，造成交叉污染洗涤后应尽量甩干孔内残液。3、注意加样顺序，加样品时应注意从最高稀释度逐一加至最低稀释度。4、底物OPD有一定致癌作用，故操作时应小心，勿使底物沾染实验台等器材。5，枪头（移液头）忌丢入实验台微生物专用的废液缸内。,ELISA的分类,直接法（Competitive ELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体 间接法（Indirect ELISA）：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原,Sandwich ELISA,indirect ELISA,ELISA检测抗原,Ag+Ab*Ag-Ab*,ELISA检测抗体,Ab+Ag*Ab-Ag*,ELISA检测抗体,Ag+Ab1 Ag-Ab1Ag-Ab1+Ab2*Ag-Ab1-Ab2*,间接ELISA（可测多种细菌或病毒的抗体，用途广泛）,显色,免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。标记免疫分析：用可微量或超微量检测的示踪剂标记抗原、抗体，检测免疫反应结果并确定待检物。,免疫标记技术,补充,放射免疫技术,免疫荧光技术,酶免疫技术,三大经典标记技术,三大经典标记技术,放射免疫RIA以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。,免疫放射IRMA以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。,放射受体分析RRA放射配体结合分析RBA,其它,放射免疫技术原理,二、放射免疫技术常用的放射性核素,125I 3H 射线 理化性 活泼 差核素丰度 90%半衰期 60.2d 12.3y标记方法 简单 复杂标记设备 低廉 昂贵测量条件 简单 复杂,常用标记核素,荧光抗体技术,荧光免疫测定,均相荧光免疫测定（homogeneous fluorescence immunoassay）,非均相荧光免疫测定（heterogeneous fluorescence immunoassay）,荧光免疫技术,荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。,荧光免疫技术的类型,荧光抗体技术的基本原理,荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。,Immunofluorescence,IF,荧光显微镜,利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。,病原体检测,寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）,细菌（藤黄微球菌),荧光抗体技术的应用,免疫病理检测,肿瘤（人肝癌细胞）,荧光抗体技术的应用,主要试剂:酶标记的抗体或抗原酶标物特点：免疫学活性 酶对底物的催化活性,抗原抗体反应的特异性,+,酶高效催化反应的专一性,酶免疫测定法原理及特点,特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。,原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,原理及特点,辣根过氧化物酶（HRP）,糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心,RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比,RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要,ELISA中应用最为广泛的标记用酶,常用酶,酶和酶作用底物,酶免疫技术,酶免疫组化,酶免疫测定,均 相,非均相,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,组织切片或其它标本中抗原的定位,液体标本中抗原或抗体的定性和定量,酶免疫技术的分类,碱性磷酸酶（AP）,菌源性AP 肠粘膜AP,半乳糖苷酶（-Gal）,用于均相酶免疫测定,常用酶,酶和酶作用底物,HRP的底物,DH2+H2O2 D+2H2O,HRP,供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种,H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高,常用底物,酶和酶作用底物,HRP的常见底物,邻苯二胺 OPD,四甲基联苯胺 TMB,5-氨基水杨酸5-ASA,2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS,常用底物,酶和酶作用底物,OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。,TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。,HRP的常见底物,酶和酶作用底物,AP的底物,-Gal的底物,对-硝基苯磷酸酯（pNPP）,4-甲基伞酮基-D半-乳糖苷（4MUG）,经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。,酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计 测量。,常用底物,酶和酶作用底物,酶免疫技术的核心组成部分,酶结合物（conjugate）酶标记物,通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物,酶标记抗体或抗原,酶联免疫吸附试验,底物显色定性或定量的分析,原理,包被,反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体,洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离,1,2,3,4,一、基本原理,固相的抗原或抗体,酶标记物（酶结合物）,酶反应的底物,三个必要试剂,二、方法类型及反应原理,双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等,ELISA检测抗原的方法,1、已知抗体包 被于载体表面,3、加酶标抗体 与抗原结合,4、加酶作用的底物产生颜色,2、加待检物抗原与抗体结合,4、加酶作用的底物 不产生颜色,双抗体夹心法测抗原,1、已知抗体包 被于载体表面,2、加待检物无抗 原与抗体结合,3、加酶标抗体 无抗原结合,+,-,Y,Y,E,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）,ELISA检测抗原的方法,竞争法测抗原,+,-,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,E,Y,2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合,3、加酶作用的底物不显色或显色弱,3、加酶作用的底物显色,1、已知抗体包被于载体表面,1、已知抗体包被于载体表面,2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合,间接法方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定,ELISA检测抗体的方法,1、已知抗原吸附于载体表面,2、加待检物无抗体与抗原结合,3、加酶标抗Ig与抗体结合,4、加酶作用的底物产生颜色,1、已知抗体吸附于载体表面,2、加待检物有抗体与抗原结合,3、加酶标的抗Ig抗体,4、加酶作用的底物不产生颜色,间接法测抗体,-,Y,E,Y,+,双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体,ELISA检测抗体的方法,竞争法原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测,ELISA检测抗体的方法,捕获法 应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体,ELISA检测抗体的方法,捕获法,原理：抗人IgM链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体 底物显色,捕获法原理,+,-,1、固相化抗人IgM,1、固相化抗人IgM,2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合,3、加特异性抗原，与特异性抗体结合,4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色,2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合,3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合,4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色,人IL-2定量酶联检测 BAS-ELISA(生物素-亲和素ELISA),一、原理 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)是一种固相酶免疫测定的方法，广泛应用于各种抗原或抗体的微量检测，其基本原理是将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，通过洗涤将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分分离，再利用各种操作方法，测定可溶性抗原或抗体。BAS-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。,本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-2单抗包被于酶标板上，标准品中的IL-2会与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-2抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素和亲和素特异性结合；抗人IL-2抗体与结合在单抗上的人IL-2结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反应孔中有IL-2，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-2浓度与OD450值之间呈正比，绘制标准曲线。,二、材料（人IL-2ELISA试剂盒）1.1ng/ml人IL-2标准品2.标准品稀释液3.生物素化抗人IL-2抗体（1:100）4.酶结合亲和素（1:100）5.洗涤液6.显色剂（过氧化氢四甲基联苯胺）7.终止液8.抗人IL-2单抗包被板条9.封板胶纸,三、操作步骤1.包被抗体：用0.05M PH9.6碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释，在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1ml，4过夜(18-24小时)。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。2.配制不同浓度的标准品：,3.加样：将稀释的不同浓度的标准品各100ul加入反应孔18孔中，同时第9孔作空白孔。37孵育60分钟，洗涤4次，0.5分钟/次。4.加B-Ab（生物素化抗IL-2）：将生物素化抗IL-2，加于每孔100ul，37孵育30分钟。洗涤4次，0.5分钟/次。5.加A-HRP（酶结合亲和素）：将辣根过氧化物酶标记的亲和素(A-HRP)，于每孔加100ul，37孵育30分钟。洗涤4次，0.5分钟/次。6.底物显色：于各反应孔中加入显色剂100ul/孔，于37温育10分钟。再加终止液100ul/孔以终止反应.7.结果判定：目测或在ELISA比色仪上测OD值。,四、注意事项1.反应物的浓度及比例：由于本法敏感性很高，所用抗原或抗体均较ELISA法为少，对生物素标记的抗体的浓度更应严格掌握，增加抗体浓度可使敏感性提高，但过大又可使非特异性随之增大。2.生物素的稳定性：生物素标记上抗体的结合物，其稳定性均比酶标记抗体为好，宜长期保存，加入等量60甘油于-20可保存2年左右。保存时切忌反复冻融，反复冻融会使制剂的活性受到损害。3.亲和素的稳定性：亲和素在一般条件下稳定，对热及多种蛋白质能耐受，但在某些金属离子存在下对光敏感，容易失活。所以在配制亲和素溶液时宜采用无离子水，在4置2个月或在-30置放半年，反复冻融其活性仍保持不变。,4.亲和素的非特异性吸附：亲和素在PH中性环境中是带正电荷的，可通过静电作用非特异性地吸附到固相载体上，这是引起试验非特异性显色的主要原因。如果增加亲和素稀释液的PH和离子强度，均可明显减少亲和素的非特异性吸附，而对特异性显色也影响不大。也可用戊二醛或醋酸酐对亲和素进行化学修饰，使之乙酰化而减少其非特异性吸附。5.反应物的作用时间及温度：由于亲和素与生物素之间有很高亲和力，故二者标记物反应时间较抗原-抗体反应时间大为缩短。为了减少非特异性吸附，反应时间不宜过长，一般于37以20-30分钟为宜。,
