《电泳技术》课件.ppt

电泳技术,目 录,第一节区带电泳 第二节等电聚焦电泳 第三节SDS-PAGE电泳 第四节二维电泳 第五节印迹技术 第六节免疫电泳 第七节高效毛细管电泳技术 第八节电泳分析仪,基本原理,不同性质的质点，由于带电性质及电量不同，在一定电场强度下移动的方向和速度亦不同。蛋白质分子为两性电解质等电点pH等电点 带负电pH等电点 带正电,质点所带净电荷量越多（介质的pH值离等电点越远）质点的直径越小越接近球形则它在电场中的泳动速度越快，迁移率亦越大。,基本原理,区带电泳,检验医学中的应用血清蛋白电泳,图 6-1 正常血清蛋白电泳图谱上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分；下图：光密度扫描后电泳图谱；HP：触珠蛋白；CP：铜蓝蛋白,区带电泳,图6-2 几种常见异常血清蛋白图谱A：双清蛋白血清电泳图；B：慢性肝病或肝硬变常见的-融合的桥连现象；C：免疫球蛋白寡克隆增生型；D：M蛋白血清型（IgA型）；N：正常对照血清；P：患者血清,A BC D,区带电泳,检验医学中的应用 同工酶电泳,图6-3 LDH同工酶区带电泳图谱左：5份血清iso-LDH电泳图；右：iso-LDH电泳示意图,第一节区带电泳,检验医学中的应用 同工酶电泳,图6-4 CK同工酶示意图左：血清iso-CK电泳图，3示正常血清（CK MB5%）；4示CK BB阳性；右：iso-CK电泳图谱示意图,区带电泳,实验原理 让pHpI（max）所有蛋白质带负电各种蛋白质带电量不同电泳速度不同经过一段时间电泳后，各种蛋白质被区分开,区带电泳,图 6-1 正常血清蛋白电泳图谱上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分；下图：光密度扫描后电泳图谱；HP：触珠蛋白；CP：铜蓝蛋白,第二节 等电聚焦电泳,检验医学中的应用次级同工酶的分离,图 6-5 碱性磷酸酶同工酶等电聚焦电泳图谱左：iso-ALP等电聚焦示意图；右：胆道梗阻性疾病iso-ALP电泳图谱,第二节 等电聚焦电泳,区带电泳的原理是不同的蛋白质有不同的电泳速度那么可不可以有另外一种方法：使得不同蛋白质在泳道中本来就有“固定”位置，蛋白质在相应的位置上停留？蛋白质如何能够停止电泳？除了切断电源之外？蛋白质不带电了蛋白质处于等电点溶液中,第二节 等电聚焦电泳,基本原理在等电聚焦电泳时必须有一个稳定的pH梯度介质，使pH值从正极向负极渐次增加，形成一线性pH梯度。蛋白质混合物加入有pH梯度的电泳管中，在电场中经一定时间后，混合物中各组分将分别聚焦在与各等电点相应的pH介质区域，形成分离的各种蛋白质区带。这就是等电聚焦电泳分离蛋白质的基本原理。,第三节 SDS-PAGE电泳,等电聚焦根据等电点将蛋白质分离那还能不能根据其他性质将蛋白质分离?区带电泳的电泳速度的影响条件较多（大小、电荷、形状），不是根据单一性质分离有一种方法能根据蛋白质的分子量使之带上相应的电荷，远远大于蛋白质本身电荷的大小，并使电荷成为电泳速度的主要决定因素，那么电泳速度只和分子量相关,第三节 SDS-PAGE电泳,SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质负载了大量负电荷，大大超过了天然蛋白质的原有电荷，因此蛋白质之间原有电荷的差异就无显著效应，蛋白质带电量的多少，只与蛋白质大小即分子量有关，此时，不同泳动速率仅反映了各蛋白质亚基的分子量的差别。,第三节 SDS-PAGE电泳,检验医学中的应用非浓缩尿蛋白电泳,图 6-7 非浓缩尿蛋白电泳示意图,第三节 SDS-PAGE电泳,检验医学中的应用非浓缩尿蛋白电泳,图 6-8 临床常见蛋白尿电泳图谱左：肾小球性蛋白尿；中：肾小管性蛋白尿，泳道4示混合性蛋白尿，肾小管性蛋白尿为主型；右：混合型蛋白尿,一个条带中仍是混合着多种蛋白质，如何再把它们分开呢？,第四节 二维电泳,图 6-9 二维电泳原理及流程图,第四节 二维电泳,基本原理第一维电泳，即等电聚焦电泳(isoelectric focusing，IEF)其基本原理是利用蛋白质分子等电点的不同对其进行分离；第二维电泳，即SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，使电泳迁移率主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。,第四节 二维电泳,检验医学中的应用,一个问题：如何确定某个条带是什么蛋白质？,图 6-1 正常血清蛋白电泳图谱上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分；下图：光密度扫描后电泳图谱；HP：触珠蛋白；CP：铜蓝蛋白,第五节 印迹技术,免疫印迹法基本原理,图 6-13 免疫印迹法的原理,第五节 印迹技术,免疫印迹法（Immunoblotting）又称蛋白质印迹(Western blot)，因与早先建立的检测核酸的Southern blot 相类似，亦被称为Western blot，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记二抗。,第五节 印迹技术,共分三个阶段进行SDS-PAGE电转移酶免疫定位,第五节 印迹技术,免疫印迹法在检验医学中的应用自身抗体检测中的应用,第五节 印迹技术,图 6-14 免疫印迹法在自身抗体ENA检测中的应用,第六节 免疫电泳,电泳技术与免疫技术相结合，大大扩大了其临床应用的范围，于1953年Grabar和Williams首次将凝胶扩散置于直流电场中进行，让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运行方向，并与免疫沉淀反应相结合,该技术有两大优点，一是加快了沉淀反应的速度，二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分离开，再分别与其对应抗体反应，以此作更细微的分析。,第六节 免疫电泳,对流免疫电泳(CIEP),图 6-15 对流免疫电泳示意图及应用（1：阳性；2：弱阳性；3/4：强阳性）,第六节 免疫电泳,火箭免疫电泳(RIE)实验原理：在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔；加入待测标本后，将抗原置阴极端，用横距23mA/cm的电流强度进行电泳。抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。随着泳动抗原的减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个状如火箭的沉淀峰。,第六节 免疫电泳,火箭免疫电泳(RIE),图 6-16 Laurell 技术示意图及火箭免疫电泳图谱Ag：抗原；1、2、3为待测标本；4、5、6为标准,第六节 免疫电泳,火箭免疫电泳(RIE)检验医学中的应用火箭电泳放射自显影定量甲胎蛋白,图 6-17 火箭电泳放射自显影定量检测AFP图谱,第六节 免疫电泳,火箭免疫电泳(RIE)检验医学中的应用血清脂蛋白ApoA1和ApoB火箭电泳,图 6-18 血清脂蛋白ApoA1和ApoB火箭电泳分析图谱1、2、3、4、5示标准；6、7、8示待测标本,第六节 免疫电泳,免疫电泳(IEP)技术是区带电泳与免疫双扩散相结合的一种免疫化学分析技术。,第六节 免疫电泳,免疫电泳(IEP)技术基本原理,第六节 免疫电泳,免疫电泳(IEP)技术检验医学中的应用,表1 血浆免疫电泳各区带所含蛋白成分,第六节 免疫电泳,第六节 免疫电泳,免疫固定电泳(IFE)检验医学中的应用,图 6-21 血清免疫固定电泳图左：IgA-型M蛋白；右：双M蛋白（IgG-、IgA-）,第六节 免疫电泳,免疫固定电泳(IFE)技术优势 周期短敏感性高分辨率好结果易分析,第七节 高效毛细管电泳技术,基本原理,检 测 器,泳 动,温 度 控 制 器,缓冲液,+,缓冲液,图 6-23 高效毛细管电泳原理图,第七节 高效毛细管电泳技术,高效毛细管电泳的分离模式毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis,CGE）胶束电动力学毛细管色谱（micellar electrokinetic capillary chromatography,MECC)等电聚焦电泳（isoelectric focusing,IEF)等速聚焦电泳(isotachophoresis,ITP)毛细管电色谱（capillary electrochromatography,CEC）亲和毛细管电泳（affinity capillary electrophoresis,ACE）电动色谱(electrokinetic chromatography,EKC)非水相毛细管电泳（non-aqueous capillary electrophoresis,NACE）,第八节 电泳分析仪,电泳分析仪的基本结构电源 可分为稳流、稳压、稳功率电泳槽电泳区带分析装置,第八节 电泳分析仪,半自动电泳分析仪,图 6-26 HELANA半自动电泳分析仪,第八节 电泳分析仪,全自动电泳分析仪,图 6-27 Sebia全自动电泳仪,谢 谢,思考题,1.二维电泳中，分别是哪二维电泳，分别根据蛋白质的什么性质进行分离？2.免疫印迹法分哪几个步骤？,