《电泳分离》课件.ppt

Electrophoresis Theory,Methods and Aplications,五、电泳技术,电泳的概念,电泳是指带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。,分辨率高，可以对混合物进行电泳分析，甚至结晶纯化的样品也可在电泳分析中分出两条带或更多的电泳带。方法温和，对不稳定的生物大分子的分离纯化有时比其它分离技术如沉淀法、离心、层析等更为方便、可靠，甚至可作为具有一定规模的制备方法。,电泳的特点,一、基本原理,当带电粒子以速度 在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。,（一）基本原理,电泳阻滞力,电场强度,物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。,（二）影响电泳速度的相关因素,颗粒性质：带电颗粒在电场中泳动的速度与带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒的半径成反比。电场强度：E 愈高，带电颗粒的泳动速度愈快。溶液性质：pH 偏离分子的等电点愈远，解离度愈大，净电荷愈多，泳动速度越快；离子强度在0.020.2为宜;泳动速度与溶液黏度成反比。,-,SO4,-,SO4,-,SO4,-,SO4,COO,-,Na+,Na+,吸附的反离子,固定基团,4.电渗是支持物本身所带的电荷吸附溶液中性质相反的离子，在电场中移动的结果。其带电愈高，电渗力愈大。当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。,5.焦耳热电泳过程中释放的热量与电流强度的平方成正比。当电场强度或电极缓冲液离子强度增高，电流强度也增加，不仅降低分辨率，严重时甚至烧断或熔化支持介质。,6.筛孔在筛孔大的凝胶中溶质颗粒的泳动速度快。,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 Polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE）,以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳方法。由于其分辨率高，不仅能分离含有各种大分子的混合物，而且可以研究生物大分子的特性，如电荷、分子量、等电点及分子构型。聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点：孔径大小可调节，可用于分离多种生物分子。机械强度好、弹性大，电渗低、分辨率高。电泳分离后仍然保持生物活性，可用于生物大分子的制备。,1.聚丙烯酰胺凝胶的合成,丙烯酰胺,N,N-甲基双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺凝胶,催化剂聚合反应,凝胶,丙烯酰胺和双丙烯酰胺量的确定,烯溶液,浓溶液,交联剂,结点,TEM(投射电镜)image of a polyacrylamide(聚丙烯酰胺),2.聚丙烯酰胺的聚合及影响因素,（1）化学聚合：以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂，使丙烯酰胺、甲基双丙烯酰胺发生连锁反应，形成网状的聚合物。pH：在碱性 pH 时，反应速率高；而在酸性条件时，同样浓度溶液，聚合速率减慢。温度：在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在25 聚合的凝胶则较透明和有弹性。O2：O2使过硫酸铵（AP）分解。,（2）光聚合：以核黄素为催化剂在少量的氧存在下,分解成无色的还原型，在少量的O2条件下，还原型的核黄素氧化成有游离基的黄素环，聚合反应发生。,核黄素B1 还原型 游离基 聚合反应,光照,O2,优点：用量少。聚合的时间可以自由控制。缺点：光照的量不容易掌握，重现性不太好。,光聚合适合于大孔径凝胶的聚合，化学聚合适合于各种凝胶的聚合。,+,蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素,蛋白质的电荷量起主要作用,蛋白质的分子大小起主要作用,蛋白质分子的构型起主要作用,三.不连续凝胶电泳的分离原理,系统的不连续性表现在以下几个方面：凝胶系统的不连续性：上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。缓冲液离子组成及pH的不连续性：电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。,（一）原理,在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。,电位梯度的不连续性,mCl-aCl-m蛋-a蛋-mGly-aGly-,1.浓缩效应,Cl-：快离子；Gly-：慢离子,电泳进行时，在快离子后面形成一离子浓度低的区域，该区域为低电导区。电导强度与电导成反比，因此，在低电导区产生较高的电场强度。在快离子和慢离子之间形成一个迅速移动的界面。样品蛋白质聚集在这个移动界面的附近，浓缩为一个狭窄的中间层（浓缩300多倍）。,2.分子筛效应,移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的pH变化明显，缓冲液中甘氨酸的解离迅速增加，迁移率超过蛋白质分子，随之高电场强度消失。当蛋白质分子量和构型不同时，通过分离胶所受到的阻滞程度不同，导致泳动率不同，结果依据分子量的大小而分开。,3.电荷效应,蛋白质所带电荷不同，泳动率也不同，故在同一电场强度中，单位时间内各分子迁移的距离存在差异。因此，蛋白质样品经分离胶电泳后，若样品组分的分子量相同，则它们将按电荷顺序排列，从而导致分离。,（二)操作,垂直柱状、板状的不连续凝胶电泳系统组成和配制,样品的准备,加样,电泳,检测,1.不连续凝胶电泳系统的组成和配制,（1）缓冲液系统,浓缩凝胶缓冲液0.5mol/L Tris-HCl,pH6.7分离凝胶缓冲液1.5mol/L Tris-HCl,pH8.9电极缓冲液系统 0.025mol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷）0.2mol/Gly(甘氨酸)pH8.3样品缓冲液 0.1mol/L Tris-HCl，pH 6.7,40%甘油、0.05mg/ml溴酚蓝,PH 8.3PH 6.7PH 8.9PH 8.3,（2）不连续电泳浓缩胶和分离胶的配方,贮存液 凝胶终浓度T 4%7.5%10%15%20%单体贮液（14.55:0.55）0.65 3.8 5.0 7.5 10浓缩胶缓冲液(ml)0.1 0 0 0 0分离胶缓冲液(ml)0 0.3 0.3 0.3 0.3dd H2O(ml)4.25 10.9 9.7 7.2 4.7真空抽气10%AP(过硫酸铵)(ul)5 15 15 15 15TEMED四甲基乙二胺(ul)2.5 7 7 7 7总体积 5ml 15ml,2.样品的准备,样品缓冲液与浓缩胶缓冲液pH相同。样品缓冲液中可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。样品缓冲液中通常加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。标准蛋白质样品：是一组（57种）已知分子量范围的、构型相近的一套蛋白质，溶解在样品缓冲液中备用。,3.加样要求,加样量一般1020l。用微量注射器距槽底三分之一处进样。注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,以免样品下沉时会发生扩散。为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样。,浓缩胶制备完毕，不宜储存，应立即电泳。对垂直板凝胶，电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当样品进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。,4.电泳,荧光探针 考马斯亮蓝 氨 基 黑 染色 银 染 色 过碘酸-Schiff试剂 阿尔辛蓝,5.检测,三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,在蛋白质样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，分子被解聚成多肽链，它们与SDS充分结合形成带负电荷的SDS蛋白质复合物，所带的电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子原有的电荷差异。电泳的迁移率不再受电荷的影响，而只与蛋白质或亚基的分子量大小有关。,（一）基本原理,lgM=a-bRf,影响SDS-蛋白质结合的因素,1.溶液中SDS的浓度,2.样品缓冲液的pH、离子强度,3.二硫键是否完全被还原,（二）、操作,凝胶浓度根据待测样品分子量大小决定，凝胶用含0.1%SDS的0.1M磷酸缓冲液配制，ACR：Bis=29：1。,1、凝胶浓度的选择,2、样品制备,样品溶于含1%SDS、0.1%巯基乙醇的0.01M磷酸缓冲液中。上样前置100oC水浴中密闭煮2-5min。,3、电泳条件,电极液为含0.1%SDS的0.1M磷酸缓冲液。,4、固定与染色,Tissue preparation,源组织,微量离心管,溴酚蓝,旋涡,Preparing acrylamide gels,浓缩胶/分离胶配置,Preparing acrylamide gels,异丙醇（水）,Electrophoresis,电泳缓冲液,Electrophoresis,染色,银染法,考马斯亮蓝染色法,Gel Blue Coomassie,Coomassie solution考马斯亮蓝溶液,SDS凝胶电泳扫描与染色图谱,M S S,S1 M S1 M S2 S2,（三）蛋白质分子的电泳迁移率与分子量的计算,蛋白质分子量的计算1.要求有一组标准蛋白质，其分子量应包含欲测分子的大小。2.欲测分子的性质、构形与标准分子类似。3.标准蛋白与被测分子在同一块凝胶上电泳。4.以标准样品的迁移率作横坐标，相应分子量的对数作纵坐标，绘制标准曲线。,lgM=a-bRf,Migration of proteins in SDS gels of varying acrylamide concentrations(%T).,9个蛋白质：分子量94 kDa 14.4 kDa,