原代心肌细胞培养方法探讨 3.docx

心肌细胞的分离及培养器械：饭盒、烧杯、弯头解剖剪（2）、小镊子（2）、平皿（4）、毛玻片、滤网、离 心管（15ml）、移液管、培养瓶、废液缸、PE手套、橡胶手套、冰盒溶液：PBS、DMEM （含血清）、DMEM（free）、胰酶动物：小鼠准备：用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至 实验结束，提前半小时将培养液、胰酶37°C温浴。培养过程：1、两个圆皿中加入5山1的PBS培养液，将小鼠浸入70%酒精5min,用小剪子及小镊 子开胸取心。2、取出的心放在一个装有PBS的平皿中，剔除心脏周边的血凝及纤维组织。3、PBS再冲洗后，转移至另一个预先装好5m 1胰酶的平皿中，用剪子将平皿中的心 脏剪成1 mm3的碎块，倒入15ml离心管中，加入3-5m 1胰酶冲洗平皿转移到离心管中。4、放入水浴锅中，温和摇动，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血 红细胞、细胞碎屑和死细胞。5、再将8-10ml胰酶加入盛有组织的离心管，吸管轻轻吹打1min，消化10min，小心 转移上清+2ml DMEM至另一离心管中，细胞悬液离心，1000转XIOmin，弃上清，加 培养基为管1。6、重复第5步，3-8次，直至全组织块消化为止。7、将多次细胞悬液经100目滤网过滤，混合。8、加入1ml DMEM重悬，显微镜下观察并计数。9、培养1-1.5小时，收集培养液中的非贴壁细胞，小心不要晃动。10、显微镜观察并计数，细胞密度调至5X 105-6X 105细胞/ml。11、4-6小时后，用培养基轻轻冲洗2次，加入培养基继续孵育过夜。或从第5步起，加胰酶10-15ml，3Omin 37C水浴，每5min用吸管吹打5ml完全培养 基终止。原代心肌细胞培养方法探讨1邵伟(山东省千佛山医院山东济南250014)周苏宁邵建华(山东大学医学院山东省立医院山东济南250021)摘要 探讨培养Wister新生大鼠心肌细胞的可靠方法。采用心肌组织块差别消 化结合化学纯化的培养方法，通过倒置显微镜、HE染色、透射电镜、台盼篮、免疫 细胞化学，鉴定心肌细胞生长情况及纯度。结果细胞生长迅速、自行搏动，细胞形 态完整，细胞内肌丝、线粒体清晰；细胞成活率达94.6% ；肌动蛋白(HHF35)经 S-P法胞浆呈现棕褐色阳性表达，纯度达96.4%。表明该方法培养的心肌细胞生长迅 速、活性好、纯度高。关键词心肌细胞；细胞培养；大鼠Explore a method of neonatal rat myocardial cells in cultureZHOU Suning, SHAO Jianhua. Medical college of Shandong university, the peoples hospital of Shandong province, 250021, ChinaAbstract To explore a reliable method of neonatal rat myocardial cells in culture. The plots of myocardial tissue from neonatal Wister rat were cultured and purified with the method of differential enzyme and 5-Bromodeoxyuridine-treatment. Microscope, transmission electron microscope, HE stains, Trypan blue stains, immunohistochemical test were determined to identification the cell. The results of myocardial cells grow rapidity, automaticity, shape intact, the cell of filament and mitochondria clearly. The cell viability was up to 94.6% by Trypan blue stains. The cell purity was up to 96.4% by Actin (HHF35) of Streptavidin peroxidase conjunction method. This method of myocardial cells in culture was grown up rapidity, lively well, high purity.Key words Myocardial Cells; Culture; Rat随着心脏病发病率逐年升高，有关心肌疾病的研究越来越受到重视，快速、理 想的心肌细胞培养是深入研究的前提，为此我们进行了原代心肌细胞培养方法的探 讨，并对其进行了一系列实验研究，现报道如下。1材料与方法1.1心肌细胞的培养 取24h内Wister大鼠，在其心脏跳动时将心脏取下，小心剪 取心室组织，用冰PBS液清洗干净后，将组织反复剪成0.51mm3的小块，加23 滴细胞培养液，用吸管轻轻吹打后分次吸取组织块悬液，将其均匀排在75ml培养瓶 底壁上，轻轻翻转培养瓶，加入含150ml/L胎牛血清、0.1mmol/L 5-溴脱氧核苷 (5-Bromodeoxyuridine； Brdu)的高糖DMEM 3ml培养液，做好标记置于37°0恒温培 养箱中3040min后，待组织块略干能贴于瓶壁上，再缓慢、轻轻地将培养瓶翻转， 使培养液浸泡组织块，继续静止培养。每天小心取出培养瓶置于相差显微镜下进行 观察，2h后就可见组织块周边有细胞伸出，1天后周围爬满细胞，34天后多数连1山东省自然科学基金资助项目(No.Q99C03) 接成片，可进行传代，用吸管轻吹组织块使其脱落移出，加入0.1%胰蛋白酶1ml, 放置倒置显微镜下观察，约35min后部分细胞呈圆形，在瓶上做好标记，弃去胰 蛋白酶液加入含有0.1mmol/L Brdu培养液510ml在标记处反复吹打，计数板计数 细胞5x105/ml,根据需要传至培养瓶（板）中培养，多数34天后长成致密单层可 用于实验。1.2 培养 心肌细胞的鉴定1.2.1心肌细胞形态观察常规倒置显微镜观察细胞形态变化、心肌细胞搏动情况， 并随时用Leica DMIRB Microsystems记录（Leica,德国）；取培养心肌细胞单层飞片 行苏木素一伊红染色（HE染色）后，光学显微镜下观察并照片。培养细胞用0.1% 胰蛋白酶消化后，离心，沉淀固定，送电镜室制片，透射电镜观察并摄片。1.2.2细胞成活率的测定 取细胞悬液，并作适当稀释106/ml，按9:1加入0.4%台 盼篮溶液混匀，显微镜下用计数器计数活细胞和死细胞。1.2.3鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（HHF35）的检测 采用链霉菌抗生物素蛋白一 过氧化物酶连接法（Streptavidin peroxidase conjunction method,简称 S-P 法）。具体步 骤如下：单层细胞飞片清洗后95%酒精固定30min； PBS洗5minx3，滴加3%H2O2 室温孵育10min；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，正常山羊血清工作液封闭，室温孵 育10min；滴加适当比例的一抗工作液，37°C孵育4°C过夜；PBS冲洗，5minx3，滴 加生物素标记二抗工作液，室温孵育20min； PBS冲洗，5minx3，滴加辣根酶标记 链霉卵白素工作液，室温孵育20min； PBS冲洗，5minx3，滴加新鲜配制的DAB显 色液显色510min；苏木素复染57min，1%稀盐酸分化1min，自来水返蓝；酒精 剃度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并摄片。2结果2.1心肌细胞形态倒置显微镜下可见传代细胞未贴壁呈圆形，贴壁后生长逐渐呈梭 形、多角形，胞核12个、呈圆形、具有12清晰的核仁，细胞大小均匀，生长 迅速，单个细胞自行蠕动，当生长成片后可见呈岛屿状搏动，搏动频率130150次 /分。培养心肌细胞HE染色细胞形态饱满、细胞膜完整；透射电镜观察细胞完整， 胞膜皱褶整齐，细胞中肌丝、线粒体清晰、分布均匀，细胞核完整。（图13） 2.2心肌细胞成活率测定 计数500个细胞，27个染色阳性，成活率94.6%。2.3肌动蛋白免疫细胞化学反应镜下观察 肌动蛋白HHF35经S-P法培养的心肌细 胞胞浆呈现深浅不一的棕褐色阳性表达，任选5张飞片，分别计数100个细胞，阳 性细胞达96.4%（图4）；而用PBS代替一抗其结果均为阴性。3讨论构成心脏的细胞中约有80%为心肌细胞外，还有主要为成纤维细胞等非心肌细 胞，本实验所取组织块尽量细小外，并一定要冲洗干净，放入培养瓶内时培养液不 要过多易于贴壁，翻转瓶时间不要过长避免干涸，采用此种方法主要是便于心肌细 胞迅速贴壁生长，培养液中加入Brdu抑制成纤维细胞DNA合成达到抑制增生的目 的1；传代时先吹去组织块，然后依据心肌细胞的特性，快消化、轻消化，可看到细 胞形态小的心肌细胞变圆，而细胞形态大的成纤维细胞仍伸展，立即中止消化迅速 传代，仍用含有Brdu的培养液培养，34天后细胞形成致密单层即可进行实验。此 种方法培养的细胞可能与含有少量成纤维细胞促进心肌细胞贴壁和生长，有研究报 道成纤维细胞条件培养液有提高心肌细胞贴壁率及搏动率的作用，表明有促进心肌 细胞搏动和生长的因子，也提示成纤维细胞与心肌细胞间可能存在着某种信号联系。我们也观察到培养的心肌细胞成片搏动长达20多天。心肌细胞搏动表明具有自律性的心肌细胞活性和状态良好；心肌细胞HE染色 观察形态和贴壁情况；透射电镜观察可观察心肌细胞的超微结构肌丝和线粒体活性 等；对台盼蓝摄取反映细胞膜损伤和细胞死亡；肌动蛋白HHF35免疫细胞化学反 映在细胞浆中阳性表达，可间接反映心肌细胞纯度。通过反复实验我们体会到： 要选择24h内的新生鼠，而以12h内培养效果最佳。严格无菌操作，打开胸腔后 迅速摘取跳动的心脏，操作要熟练快捷。细胞贴壁生长成致密单层后尽早进行实 验，否则会降低心肌细胞的纯度，不利于对单纯心肌细胞的研究。传代消化时胰 蛋白酶浓度不要过高，时间不要过长，最好在显微镜下观察，以免较牢贴壁的非心 肌细胞浮起。选用飞片要薄，要紧贴培养瓶（板）不要留有气泡，可滴加少许培 养液后再放置飞片。要注意培养液的稳定性，适量的血清浓度，适宜的pH。只有 这样才能培养出生长迅速、纯度高、活性好的心肌细胞。4参考文献1. Karliner JS, Honbo N, Epstein CJ, et al. Neonatal mouse cardiac myocytes exhibit cardioprotection induced by hypoxic and pharmacologic preconditioning and by transgenic overexpression of human Cu/Zn superoxide dismutase. J Mol Cell Cardiol, 2000 Oct; 32(10):1779-86.2. Suzuki T, Tsuruda A, Katoh S, et al. Purification of endothelin from a conditioned medium of cardiac fibroblastic cells using beating rate assay of myocytes cultured in a serum-free medium. J Mol Cell Cardiol. 1997 Aug; 29(8):2087-93.3. Rohr S, Scholly DM, Kleber AG Patterned growth of neonatal rat heart cells in culture: morphological and electrophysiological characterization. Circ Res, 1991, 68:114-130.图3心肌细胞透射电镜（X20000）图2心肌细胞HE染色（x40）图 4 心肌细胞 Actin-HHF35 (x20)