代谢网络的定量分析.ppt

第六章 代谢网络的定量分析,复杂的网络代谢理论为系统研究微生物提供了新的平台。代谢网络应用主要是生物体内发生的多个化学反应的总和。根据研究目的的不同，代谢网络可以表达成三种不同形式的图：代谢物图、反应图、二分图。代谢物图是把代谢网络中的代谢物看成是图的边；反应图是把酶看成图中的结点，连接两个连续反应的中间复合物看成是图的边；二分图是把代谢物和酶看成两种不同类型的结点。,用代谢网络定量分析的方法来解释细胞代谢的调控日益引起重视。在国外，1994年 NIESON将代谢工程的定量分析方法，作为单独的一章加以介绍。近几年代谢网络定量分析法发展迅猛，各种方法不断涌现、发展，国内在 1996年 7月的第七届全国生物化工学术会议上才有涉及定量分析的研究论文出现。,代谢网络途径分析从简单地分析代谢反应挂图已发展到最近的深入研究代谢网络结构的理论。代谢途径的确定于提供一个以整个代谢功能和表型为出发点进行途径定位方法是必不可少的。对于这种鉴别和分析的方法，最有发展途的是利用凸分析原理，这些原理包括最近提出的元素模概念和极端途径模型，两者都能用于确定代谢网络的生产力的界限。途径分析用到一些数学概念，如零空间和凸多面的应用，,途径分析在基因识别和生物技术上有很大应用前途由于对细胞代谢结构的深入理解和巨大的基因组信息在当可被利用，生物化学家和生物技术家将能得出细胞的完整代谢图并通过合理、定向的代谢工程来对它进行重新设计。,代谢网络应用理论基础,显然，利用数学工具进行分析是一个重要的方面。1960，匈牙利数学家艾尔德(P.Erds)和莱利(A.Rnyi)提出，用随机作图理论来分析网络的拓扑复杂性。他们的这一理论后来成为分析网络的经典数学方法，被称为“ER理论”，其研究的网络则被称为“ER模型”。,ER模型建立在随机过程上，即一定数量的节点彼此完全随机地连接在一起，每个节点具有相同数量的连接。因此，这种模型在统计意义上是一种均一性网络。最近几年，随着大量数据的产生和计算机的应用，人们发现在现实世界里真实的网络与ER模型相差甚远。这些真实的网络既不是概率为零的绝对规则连接网络，也不是概率为1的完全随机连接的网络，而介于这两者之间。科学家把种类型的网络称为“小世络”(small-world network)。,研究者发现，线的神经网络就是一种典型的小世界网络。许多自然状态下的网络还表现出一特别的属性：少数节点的连接数远高于平均的节点连接数。这类网络被称为“由规模网络”(scale-free network)，属于高度非均一性的网络。它具有真网络中最常见的两个特性：增长(growth)和偏好连接(preferential attachment研究者利用基因组数据库，对动物、植物、微生物三大类型中的43种生物体的谢网络进行了分析，发现这些代谢网络均遵循着自由规模网络的设计原则。,代谢网络研究的主要研究成果,近几年，在代谢网络方面国外作了大量的研究。H.Jeong,H.Tombor等利用SAYTHS技术研究了43种生物的细胞代谢网络得出：1、它们都是自由规模网，这些网都是强健的和耐受出错的(error-tolerant)，也就是抗干扰的。2、具有小世界特性：任何两个底物(节点)都可以有少量的代谢反应(连接点)与其连接。,3、高度连接的是底物而很少连接的则是种属特异性酶的产物。4、生物网络都是统计异质的，也就是说不同的节点由不同的连接数(k),符合倍数定律分布，也就是说在这样的网中，新的节点偏向于和已经连接了节点的节点连接。此种网即强健又具有抗出错能力。5、所有已测定的43种生物的代谢网络的结构和规模都是一样的。6、所有已测定的生物的平均连接数目(两个节点之间的连接数目)都意外地相近，在3左右。,7、如果一种底物(节点)由于催化其反应的酶的突变而突然降低，则很快就可能有一条最短的生化代谢途径和少数新酶的表达，通过更大的网络半径来补救。8、E.coli代谢网络计算机模拟和在体突变(In silico and in vivomutagenesis)研究表明，细胞可以耐受若干代谢酶的删除。9、拥有最多连接的节点也就是“hubs”在所有已测生物中都一样。对于微生物的,蛋白质之间的互作网研究表明，自由规模网有惊人的对抗意外损伤的能力，即使80%的随机选定的节点断裂，保留的20%仍能形成互联簇，使任何两个节点间连接。当然，这一特征依赖于hubs。在酵母菌中，010%的蛋白质少于5个连接，大于60%的多于15个互连（互相作用），这表明蛋白的互连度在决定缺陷基因表型中具有重要作用，,只有18.7%的酵母基因（14.4%的大肠杆菌基因）缺失使细胞致死。很多大肠杆菌的基因同时缺失甚至不会发生任何表型变化。证明很多基因在自由规模网中不具有主要作用。,由于代谢网络结构是一种并行的结构，加上生物体本身的复杂性，单靠单一的定量分析方法对复杂网络很难得出完美的优化结构。从国外研究来看，定量分析方法本身尚处于不断发展中，新的方法也不断出现。这些方法的出现、发展、完善，再加上与新的并行处理方法，如神经网络、遗传算法、进化规则、细胞自动机模型、计算机技术等方法结合，代谢工程定量分析必然会有更大的进展，从而为发挥代谢工程的潜力和代谢工程的广泛应用开辟广阔的前景。,一、代谢网络定量分析的研究意义与目的,在由代谢途径组成的代谢系统中，往往几种调控机制同时发挥作用传播到整个代谢系统。因为在分子水平上影响代谢通量的因素众多，在确定的环境中，对通过特定的代谢途径的代谢通量变化往往存在各种各样的解释。,如果这些解释使用的是定性的方法，就很难对这些解释进行评价了。在这种情况，用代谢网络定量分析的方法来解释细胞代谢的调控日益引起重视。在国外1994年 Bailey 在 Science 中将代谢工程的定量分析方法，作为单独的一章加以介绍。,近几年代谢网络定量分析法发展迅猛，各种方法不断涌现、发展。国内，在 1996 年 7月的第七届全国生物化工学术会议上才有涉及定量分析的研究论文出现。,鉴于代谢网络定量分析在代谢工程中的基础性作用，下面将具体介绍国内外近几年在该方面的研究进展。,二、代谢网络定量分析的基本理论,代谢控制分析（MCA）的基本理论及应用 代谢通量分析（MFA）的基本理论及应用 生化系统理论（BST）的基本理论及应用 控制论模型（CM）的基本理论及应用 途径分析的基本理论及应用,代谢控制分析（MCA）的基本理论及应用,MCA是在生化反应系统敏感性分析的基础上发展起来的，是研究分析代谢途径中代谢控制在各个反应步骤之间如何分配的理论。这一理论可以用数学形式表达，也可以同实验方法结合对 细胞代谢的调控问题 提出定量的解释。,随着对复杂代谢现象认识的需要和在生物技术中研究和应用实例的积累，代谢控制分析理论日益引起广泛的关注。,基本理论,MCA 的基本研究对象是由代谢反应步骤以及代谢反应途径组成的代谢系统，单个反应步骤是组成系统的基本单元。MCA 认为 代谢系统中所有反应步骤都对代谢通量和代谢物浓度进行控制，因此对其中一个反应步骤施加微扰而产生的代谢通量（或代谢物浓度）变化的大小，可以作为代谢系统分析理论的基本概念。,根据以上概念，在假设代谢系统是直线式代谢途径（恒态代谢系统中任何两个反应步骤是通过唯一的共同中间代谢物连接的），而且系统内代谢物是均匀分布的基础上，可以导出总和原理和连通原理。这些概念和原理就形成 MCA 理论的基本形式。,根据MCA理论,代谢控制是细胞内代谢的系统属性,并可以用酶动力学性质进行定量表示。MCA指出了“限速步骤”观念的局限性,认为代谢途径中酶促反应步骤对代谢的控制作用随系统内外条件的改变而变化。用理论计算或试验确定的控制系数能够加深对代谢的控制结构特性的理解。,代谢控制分析定义了一些重要的表征参数，如通量控制系数、浓度控制系数、弹性系数等，它们分别表示某一酶水平变化对 速率分布 或 浓度分布 的影响及 底物浓度变化 对速率分布的影响。,通过对其进行比较即可找到 限制性步骤 和 关键酶，为代谢工程提供了目的位点。利用 加和原理、连接原理 等可由某些参数确定那些难以直接测量的参数。,控制系数 是指 在生理条件(即某一恒态)下，对代谢系统中某一步反应施加一个微小扰动，所引起指定的 代谢通量 或 代谢物浓度 的相对变化 与 该反应的反应速度 Vi 相对变化之比：,上式中如果 A 代表指定的代谢通量，则 称为该步骤关于这个 通量 的 通量控制系数。上式中如果 A 代表指定代谢物的浓度，则 其 称为 该步骤关于这个 代谢物 的 浓度控制系数。,弹性系数 是指在一个与代谢系统中某一步反应具有相同参数的酶促反应中，对该反应某一参数 p(如底物、产物、酶浓度、温度、效应物等)进行微扰，所引起的反应速度 Vi 的相对变化与该参数的相对变化之比，即:,而 总和原理 与 连通性原理 则是在假设代谢系统是直线式代谢途径(恒态代谢系统中任何两个反应步骤是通过唯一的共同中间代谢物连接的)，系统内代谢物是均匀分布的情况下推导出的。,局限性,控制系数 是否可以描述代谢的调节与控制，这在 MCA 出现伊始就引起质疑，其原因包括以下两点：与变构酶的效应物作用相比，酶浓度不是对代谢调控特别有影响的参数；,控制系数 是否可以作为 代谢控制的标准 值得怀疑，因为 控制系数 只在测量条件下有效，并且随着系统状态的变化而变化，因此是 作用有限的预测值。有学者认为代谢网络中的 调控作用 不一定是 通量控制。,当涉及 MCA 的 连通性原理 时，要求对代谢系统中的所有反应及酶与代谢物的中间反应等都鉴别清楚。而在实际应用中，一般典型生物的代谢知识太少，对其他具有利用潜力的生物更是所知不多。,这是 MCA 理论应用的“瓶颈”。目前已经发展了一种称为“自上而下”的实验方法拓展了 MCA 的应用前景，可以用来对 复杂代谢系统 进行代谢控制分析。,MCA 在指导代谢工程方面的能力还存在问题。MCA 只能处理 恒态下的代谢系统，并且代谢通量的控制分布 只能在对 反应速度微扰的情况 进行评估，所确定的 控制系数 只对该恒态有效，所以在代谢工程中用 MCA 来指导 另一种恒态下 代谢系统的调整 是有疑问的。,此外，以 MCA 为设计基础的 代谢工程 多集中在 对酶浓度的调整上。但是 通量控制系数较大的酶 有时不能进行调整，如 在具有 反馈抑制机制 的 直线式代谢途径中，受抑制的酶常常控制着代谢通量。,通常的做法是考虑 解除 反馈抑制，而不是提高 受反馈抑制的酶的活力。目前在 MCA 中有学者运用了一种 定位诱变(site-directedmutagenesis)的策略来解决此问题。,应用,MCA的重要特点之一 是能够结合具体酶的反应动力学性质，来说明 代谢网络特性。如利用与代谢网络中某一步反应具有相同参数的 酶促反应的速度方程 求导得到 弹性系数，或通过 体内实验 测定 弹性系数，利用连通性原理可以确定网络中的 控制系数。,随着理论研究的深入发展，代谢控制分析已经大大突破原有假定条件的限制，发展到可以对含有分支途径、循环、酶-酶相互作用、级联反应等各种结构形式的代谢系统进行代谢控制分析。,MCA在研究复杂代谢网络中的进展，不仅加深了对代谢网络中控制结构的了解，而且对不同代谢系统类型的控制分析更加系统化，形成了所谓的矩阵方，并且促进了计算机技术在这一领域的应用，显示出 MCA 应用于代谢网络分析和评价的广阔前景。,代谢途径中的限速步骤,MCA的研究突破了传统的限速步骤观念,使人们对代谢的调控有了更加全面的认识。长期以来,人们一直认为代谢途径存在着固定的限速步骤,它们控制着通过代谢途径的代谢通量,主要表现在:限速步骤的反应速度很低,整个系统的代谢通量取决于此步骤酶的活性;限速步骤是热力学不能进行的反应,具有很高的平衡常数,需要由与其偶联的、热力学上容易进行的反应驱动;限速步骤受制于该步骤酶活性与酶合成的调节。,代谢通量分析（MFA）的基本理论及应用,因为 代谢通量 是构成 细胞生理学 的基本决定因素，所以 体内途径通量大小的精确量化 是 细胞生理学 和 代谢工程 中一个重要目标，尤其是从 代谢生产 的角度看，总是希望尽可能的将底物转变成有用产物。,代谢通量分析（MFA）是 代谢途径通量确定的一个强有力的方法，因此，通过利用 主要胞内反应的 化学计量模型 及应用围绕代谢物的 质量平衡关系，就可计算出 胞内通量。,基本理论,代谢通量分析是根据代谢路径中各反应的计量关系以及实验的某些底物、产物的通量和细胞组成等来确定整个代谢网络的通量分布。该方法的基础是准稳态假设。,假设细胞内的中间代谢物均处于准稳态，即其浓度变化速率为 0，这样由 n 个中间代谢物即可得到 n 个关于速率的约束条件（由计量关系确定），若选定的速率的总数目为J，则待解问题的自由度为 F=J-n。这样通过实验测出 F 个不相关速率可确定整体通量分布。,应用,计算细胞内部通量分布；计算某些难以直接测量的外部量的变化速率；确定代谢路径中刚性节点及控制步骤；计算理论得率；确定胞内代谢路径；分析替代路径对通量分布的影响；,应用代谢通量法分析黄原胶发酵实验数据 思路：首次采用 代谢通量分析法 对黄原胶发酵过程的实验数据进行了 定量分析，根据黄单胞菌的胶合成及糖分解代谢机理 求得了产胶期的内部 代谢通量分布，得出了得率与呼吸商间的关系式；并根据一定维持机理求得了维持系数、P/O 及 理论得率等。,具体实例,其中产胶期黄单胞菌内部 代谢通量分析 如下：对各中间代谢物按 准稳态假定 可得各速率间具有以下计量关系:5 r1+r2-r0=0 r6-r1=0 r3+p r6-r2=0 r4-r2-r3=0 r5+a r6-r4=0 2 r1+2 r2+r4+4 r5-r7=0,写成矩阵形式可表示为:,矩阵 A 的秩为 6，须确定的速率变量共 8个，则方程自由度为 2，测出两个速率即可完全确定代谢网络中的通量分布。在黄原胶发酵实验中通过离线分析可以测得不同时间的细胞、糖及黄原胶浓度，对其进行数值微分即可求得糖消耗速率及黄原胶合成速率；,由出口气体组成可以测得氧消耗速率OUR 及二氧化碳释放速率 CER。除以细胞浓度即可求得相应比速率 rs、rp、SOUR 及SCER。本实验采用 Amanullah 的数据进行分析。,在150L规模的发酵罐中，产胶期rs 约为0.3h-1=10mmo1g-1h-1,rp约为0.21h-1=7.5mmo1g-1h-1,SOUR约为1.9mmo1g-1h-1,SCER约为1.6mmo1g-1h-1。这些外部测得速率与前面分析的细胞内部代谢速率的关系如下：rs=6 r0，rp=(30+3p+2a)r6，SOUR=0.5 r7，SCER=r4+2 r5,代谢网络的自由度为 2，只需测得两个变量即可确定通量分布。假定测得 rs、rp，则 r0、r6 可直接求出，代入前面的矩阵方程中即可求得其它速率。结果为：,r0=0.167 rs，r1=r6=rp/(30+3p+2a)，r2=0.167 rs-5/(30+3p+2a)rpr3=0.167 rs-(5+p)/(30+3p+2a)rpr4=0.333 rs-(10+p)/(30+3p+2a)rpr5=0.333 rs-(10+p+a)/(30+3p+2a)rpr7=2 rs-(58+5p+4a)/(30+3p+2a)rpSOUR=rs-(29+2.5p+2a)/(30+3p+2a)rpSCER=rs-rp,黄原胶发酵代谢通量分布图,按文献取 P=0.38，a=0.6，则可求得代谢网络中各步的通量，若将葡萄糖的碳摩尔流入量看作100，则归一化得到通量分布。由上图可看出，G-6-P 是一关键分支点，此处70%的磷酸葡萄糖进入胶合成路径，其它则分解产能。,如果采用一些手段提高合成路径中酶的量及活性，则可使更多的 G-6-P 进入合成路径，提高产胶速率及得率。这里还有一个能量平衡的问题，即糖分解代谢产生的 ATP 与产胶和维持消耗的 ATP 相等。设法提高糖代谢的能量产生效率亦可使胶得率提高，所以一部分将对能量代谢进行详细讨论并计算出理论得率。,如果改变操作条件，则细胞产胶和耗糖的速率均会发生变化，得到不同的通量分布。若某一分支点的通量分布在不同操作条件下变化不大,则可认为其是一个刚性节点,应设法加以克服。,呼吸商 RQ=SCER/SOUR，将前面得到的 SOUR、SCER 计算式代入则可得到呼吸商与得率 Yp/s 的关系为：Yp/s=,通过这一关系，在发酵过程中就可以通过易于在线测量的呼吸商的值估计得率大小。,通过 rs、rp 根据通量模型求得的 SOUR 及 SCER 值分别为 2.78 和 2.5mmolg-1h-1，均大于实测值，而且发现 p、a 取不同值时对计算结果影响也不大。出现误差的原因可能有两方面：,一是 数据本身的误差，间歇和流加发酵都是一个动态过程，只能将发酵过程分为几个不同阶段，认为各个阶段内基本上处于稳态，由测得速率进行通量分析。由于一些关键参数如细胞浓度、底物浓度等本身就有一定的测量误差，微分求得速率误差更大，影响到计算得到的通量分布的准确性。,二是 氧限制的存在，黄原胶发酵液粘度很高，发酵后期罐中出现死区，造成氧限制。此时细胞由于供氧不足而使得葡萄糖可能经其它途径分解产生 ATP，使得模型预测结果与实验结果产生较大偏差。然而在缺氧情况下黄单胞菌如何利用葡萄糖，产生何种副产物目前还未见文献报道，因而此处的网络模型中还不能包括这一部分，对此须进一步深入研究。,生化系统理论（BST）的基本理论及应用,生化系统理论（BST）是与 MCA 同时在20世纪70年代发展起来的一种代谢网络分析方法。,基本理论,生化系统理论（BST）是指基于最优化原理寻找一种使目标最优的网络状态。它需要建立反应各速率与其影响因素（如酶、底物、效应物浓度）之间关系的关联式，给定约束条件（如酶、底物浓度的变化范围），目标函数为最大化某一速率（产物生成）。,求解此约束条件最优化问题 即可得到目标最优时的网络状态，为采用基因工程技术改进代谢结构提供指导。,应用,生化系统理论以线性优化程序优化代谢流网络。在生化系统理论中，把特定的最大化通量权值总和定为客体功能。,Papoutsakis 和 Meyer 等人研究了糖化菌产丁醇和丙酮等化合物的生化过程，把与发酵过程有关的反应式写成化学计量方程组，解出这些方程并有效化，使目标得到优化。,Papoutsakis 和 Meyer,Torres 等人构建了数学模型，用S-系统表示生化系统。这种系统能用线性规划优化柠檬酸积累过程。结果发现，把代谢物库维持在一个狭窄的生理范围内并允许酶浓度在 0.1-50 倍基本值的范围内变动，有可能使糖酵解代谢流增长二倍（当保持100%的底物转化率时），要达到这个目标，有必要同时调整7个或更多的酶。,控制论模型（CM）的基本理论及应用,控制论模型在代谢工程中的应用是由Ramkrishna 等人提出 并 发展起来。,基本理论,现代控制理论以 状态变量概念 为基础，利用 现代数学方法 和 计算机 来分析、综合复杂控制系统，适用于多输入、多输出、时变的或非线性系统，核心是 最优控制理论 和 最优估计理论。,其观点是把微生物本身看作是一位“优化战略家”。因此，当提供给它不同的营养组分时，微生物会自动调整 关键酶 的 合成 和 活性。改变组分的目标是达到 最大化生长率 或 最大化产率。,这种理解已被用于描述试验的调节现象。控制论模型认为 独立代谢途径内的每一步资源分配被优化，相应地 每一步均按控制论原则来调节。,在以上理论的基础上，Varner 和Ramkrishna 发展出一种通俗的理解法：导引原则，这种原则可以形成控制论上的受控变量，以导引原则构建 代谢过程图。,Varner 等人用这个模型描述含碳贮存化合物的合成过程。通过基因改变研究系统性能的变化，用CM作为诊断工具测试各种预测计划，并在 CM 框架内描述 酶活性的改变 和 途径酶的过量表达。,应用,途径分析的基本理论及应用,代谢网络途径分析从简单地分析代谢反应挂图已发展到最近的深入研究代谢网络结构的理论。,基本理论,代谢途径的确定可以提供一个以整个代谢功能和表型为出发点进行途径定位的方法。对于鉴别和分析的方法，最有发展前途的是利用凸分析原理。,这些原理包括最近提出的 元素模型概念 和 极端途径模型，两者都能用于确定 代谢网络的生产能力的界限。途径分析用到一些数学概念，如 零空间 和 凸多面锥 的应用。,途径分析在 基因识别 和 生物技术 上有很大应用前途。由于对 细胞代谢结构 的深入理解和巨大的 基因组信息 在当今可被利用。,途径分析的最新发展为 凸分析在代谢工程上的应用。在代谢通量分析中我们知道，由于许多通量被各种不等式约束，使得传统的线性代数不能被用于处理这种数学上的等式/不等式体系，这迫使利用 凸分析 来研究 空间特性 以解决这个难题。,Liao 等发现代谢物产率最终受从中心代谢到所需的生物合成途径的分支代谢流能力的限制，因此重建中心代谢是高产的基本条件。从途径分析开始（仅需反应网络化学计量数据），结合凸分析，这种方法可用于测定基本反应模型。,应用,Seressiotis 等人应用人工智能技术发展了一种软件系统用于代谢途径分析，建立了一个可自由扩展的数据库系统，含有酶和底物的信息。可用一种搜索算法寻找需要的信息，用于定性预测增减酶活性对细胞环境和代谢调节的影响，帮助找出合适的基因型或有助于产量提高的基因修饰。,利用途径工程改造阿维链霉菌生产合成单一高效组分B1a 和 提高活性组分产量的研究进展。通过途径工程构建生产单一组分的菌株 C5-氧-阿维菌素 B 的生产 提高阿维菌素中 B1：B2 的比例 ave R 基因失活提高阿维菌素产量,具体实例,阿维链霉菌发酵产生 8 个组分，其中只有B1a 和 B1b 两个组分有较高杀虫活性，特别是 B1a 的活性最高。这 8 个组分在结构上的差异集中在 3 个位置上。,通过途径工程构建生产单一组分的菌株,日本的 Ikeda 和 mura 分离到 2 个突变株K2021 和 K2034。在 K2021 菌株中，作为聚酮链合成起始单位之一的异丁酸的前体 缬氨酸的掺入受到了抑制，因此仅产生阿维菌素的“a”组分。而 K2034 仅产生“B”组分，则是由于该株系 aveD 基因发生点突变，C5 位 O-甲基转移酶失活，该酶催化将“B”组分转变为“A”组分。,通过将 K2021 和 K2034 株进行杂交得到了仅产生阿维菌素 B1a 和 B2a 而不产生其它组分的菌株。进一步，在仅产生 B1a 和 B2a 的重组株 K2038 中通过 PCR 的方法在 aveC 区域引入点突变，这样得到了仅产生单一组分 B2a 的菌株，B2a 组分可通过化学加氢的方法再转变为毒性较低的伊维菌素 B1a。,从阿维菌素基本结构出发，对某些基团进行适当修饰，合成阿维菌素的新衍生物，是农药创新的重要途径之一。在这些衍生物中，C5-氧-阿维菌素 B 衍生物就可增加其活性。,C5-氧-阿维菌素 B 的生产,Ikeda 等在研究 aveD 和 aveF 基因的功能时，曾在 aveF 内部引入移码突变，导致客观存在编码的 5-酮基还原酶失活，不能将 C5 位的酮基还原成 OH，因此即便由 aveD 编码的 C5-氧-甲基转移酶存在，也不能将 C5 位酮基甲基化，该突变株只能产生 C5-氧-阿维菌素 B。,中国农业大学的 陈芝 等采用破坏 aveD 基因的策略，将 7.0 kb 的 pCZ2 质粒通过同源重组到染色体的 aveD 基因中，因质粒内部可能有终止子序列，导致了下游 aveF 的不能表达，因而合成的产物也是 C5-氧-阿维菌素 B，该产物经肟基化后，其杀虫活性更高。,野生型阿维链霉菌合成的 B1：B2 一般为12，如果能提高此比例将会减少工业化提取程序。Stutzman-Engwall 等人构建了一系列含有 aveC 基因野生和突变阅读框的重组表达质粒，找到了可提高此比例的重组表达质粒，引入宿主后与染色体发生重组，最后得到了一系列比例提高的突变株，有的达 2.5：1左右。,提高阿维菌素中 B1：B2 的比例,Stutzman-Engwall 等克隆了两个基因aveR1 和 aveR2，这两个基因负责调控聚酮合成酶基因的表达与阿维菌素合成酶基因的表达，他们发现使这两个基因中的任何一个基因或同时两个基因失活将会使阿维菌素产量有大幅度的提高。,ave R 基因失活提高阿维菌素产量,他们构建这两个基因替换质粒载体 pSE210、pSE214，与宿主染色体发生重组后分别得到了 aveR1、aveR2 基因缺失的和 aveR2 基因失活的突变株，突变株的产量比原菌株提高了 3.13.4 倍。,三、展望代谢分析方法的发展方向,由于代谢网络结构是一种 并行 的结构，加上生物体本身的复杂性，靠单一的 定量分析方法 对 复杂网络 很难得出完美的优化结构。从国外研究来看，定量分析方法本身尚处于不断发展中，新的方法也不断出现。,这些方法的出现、发展、完善，再加上与新的并行处理方法，如神经网络、遗传算法、进化规则、细胞自动机模型、计算机技术等方法结合，代谢工程定量分析必然会有更大的进展，从而为发挥代谢工程的潜力和代谢工程的广泛应用开辟广阔的前景。,Content,代谢物流分析 细胞代谢流的测定代谢网络的构建 直接构建间接构建代谢物流分析的计量学基础,细胞代谢流的测定,细胞内外代谢流量的测定是计算得出整个代谢网络流量详细分布的基础，是代谢工程的重要分析技术，是对代谢网络进行定量分析的依据。测定细胞内外代谢流量的数量越多，得到的代谢流分布就会越接近实际。在进行代谢定量分析时，实验数据必须满足下列要求：第一 完整性第二 无干扰性 第三 重现性,代谢流分析定义,是一种计算流经各种途径的物流的技术，用于描述不同途径的相互作用和围绕支点的物流分布。,代谢物流分析的意义,代谢物流分析属于途径分析方法，是一种计算通过各种途径的物流的强有力的技术。为了更好的了解生长细胞的行为，可将养分的代谢、能量交换及其相互关系同细胞的行为关联。通过对碳中枢代谢途径与载流途径的控制可以改善细胞培养特性，获得更多产物。,有关代谢分析的研究方法,1.详细生理学分析2.代谢通量分析（MFA）；3.代谢控制分析(MCA)；4.生化系统理论；5.动力学模型；6.途径热力学分析等。,代谢流的研究任务,对已知途径而言，是了解生物过程环境变化时对代谢流及其分布的影响，确定流向终产物的比例；对未知途径而言，是主要途径的鉴别，副产物途径的了解以便指导遗传操作，克服微生物自身的遗传机制，去除副途径。,代谢流与代谢工程的关系,代谢工程是对细胞内代谢途径进行定向的、有目的地改造以便更好地理解和利用胞内代谢进行化学转化、能量转导和超分子组装。代谢工程应该是对生化反应代谢网络有目的地修饰；其研究对象是代谢网络，最终的目的是改变代谢流，提高目的产物的产率，但它不同于传统菌株无目的的改造，它是一种有目的、有理性的改造。,代谢物流分析应用,（）定量各途径的物流和测量流入细胞内的碳。（）鉴别细胞途径中的分支点通过比较不同突变株和不同操作条件下的各途径的物流分布可以鉴别途径的节点是刚性、半刚性、还是柔性。（）不同途径存在的鉴别识别胞内是否存在某代谢途径。,（）非测量所得的胞外物流的计算（）考察另一些分布的影响关于代谢物生产的优化，可鉴别一种或几种提高代谢物得率或消除所需代谢物的物流的限制作用。（）最大理论得率的计算,代谢流分析揭示了代谢流的静态分布“当外部环境在一定范围内变化时,合成速率和转化速率的相对稳定性需通过代谢控制分析解决。其核心为弹性系数(弹性系数为单位代谢物浓度,如抑制物浓度,变化引起的酶反应速率的变化)和流量控制系数(单位酶变化量引起的某分支稳态代谢流量的变化,表明一个系统对其组成变化的敏感程度,用以衡量此反应对体系的控制程度)，两者相互关联,其值可直接或间接测定。,代谢流分析是代谢分析的一个重要手段,它假定细胞内的物质、能量处于一拟稳态，通过测定胞外物质浓度根据物料平衡计算细胞内的代谢流，放射性标记、同位素跟踪等的应用使代谢流分析更简单、方便。通过对细胞在不同情况如:改变培养环境、去除抑制、增加或减少酶活等的代谢流分析可确定节点类型!确定最优途径、估算基因改造的结果!计算最大理论产率等。,赖氨酸产率变化时,其合成途径众多节点的代谢流量分配的明显改变仅发生3个节点:6-磷酸葡萄糖(G-6P)，磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和丙酮酸(Pyr)。以葡萄糖酸盐代替葡萄糖发酵,发现G-6P节点的NADP代谢流降低50%，赖氨酸产率保持30%不变；通过DNA技术削减6-磷酸葡萄糖异构酶90%的活性，赖氨酸代谢流分率不变，但总代谢流降为原来的75%。,由此，确定G6P节点是挠性的,磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸中定有刚性节点;随后的分析表明Pyr为挠性,PEP为刚性。对青霉素生物合成通过代谢流分析进行研究时发现:其前体之一半胱氨酸由硫氢化途径合成时青霉素产率高于由转硫化途径合成的产率。,结合动力学模型对青霉素的生物合成途径进行代谢控制分析，发现:在分批培养的不同阶段,代谢流控制发生很大变化“培养的第一阶段,代谢流量控制主要发生在第一步:由ACV(L-A-amino-adipicacid-L-cysteine-D-valine)合成酶形成三肽LLD-ACV。而后的培养中,代谢流量控制主要发生在第二步:由异青霉素N合成酶将LLD-ACV转化为异青霉素N。,热力学分析，数学模型等也是代谢分析中常用的方法。应用酶动力学模型结合代谢流分析研究大肠杆菌中lac启动子下的基因表达中的某些参数，如:阻遏蛋白对lac启动子的亲和力的变化引起的代谢流的变化,结果与实际情况相符合。,代谢改造,在代谢分析确定限制步骤基础上进行代谢设计，采用对代谢途径进行调控，即对菌种的遗传物质进行定性或定量改造，然后再进行分析、设计改造，最终完成代谢工程改造菌株的循环。所有影响DNA重组技术的因素都将影响代谢改造的最终结果,如启动子的更换!基因拷贝数的多少等。,代谢流量的测定主要方法,常规测定方法核磁共振法蛋白质的质谱研究技术双向凝胶电泳（2-DE）图象分析（image analysis）质谱技术（MS）蛋白质坚定的数据库搜索法基于同位素示踪的各种联合测定方法。其他联合测定方法,常规测定方法,发酵液中的各物质成分的变化可直接测得。可离线方式测定 也可利用生物传感器和自动控制系统进行在线跟踪测定。测量细胞内的代谢物，要把细胞从发酵液中分离出来。基本上采用两种分离步骤，即离心和过滤。离心结合穿过硅油的过滤是一种非常实用的技术，称为离心过滤法。可用特定酶分析测量生物粗萃液的许多酶活。蛋白质浓度可用二维凝胶电泳测定，但鉴别各种酶需要相应的参比标准。,核磁共振法 已经成为分析细胞萃液和整体细胞中代谢物浓度的有力工具。不同原子核、不同化学基团或化合物的NMR波谱位置差别很大,蛋白质的质谱研究技术,蛋白质组研究的目的是要获得细胞、组织、有机体内的蛋白质种类、翻译后修饰、分布、表达时间、表达量等信息，从而阐明基因组的功能。研究方法是 首先分辨细胞或组织内所有的蛋白质，然后进行鉴定识别。目前，一般采用的方法是：双向凝胶电泳分离蛋白质，扫描仪定量分析，质谱法进行鉴定。,双向凝胶电泳（2-DE）,每种蛋白质都有特定的等电点。首先把纯化完毕的蛋白质在PH梯度凝胶中等电聚焦，然后再进行SDS-PAGE电泳，使其按相对分子量大小分离开来。目前，高分辨率的双向凝胶电泳可以分辨到1000-3000个蛋白质点，最高可达到1万个,图象分析（image analysis）,选用扫描仪对细胞2-DE图谱扫描并数字化，再以二维分析软件对数字化的图谱进行各种图像分析，比如图形处理，斑点定位与量化、2-DE匹配比较以及统计分析等,质谱技术（MS）,仪器分析的主要内容 光学分析（原子发射光谱法、原子吸收光谱法、X-射线分析法、红外和拉曼光谱）、核磁共振波谱法、电化学分析、色谱分析、质谱分析 如何学习仪器分析，掌握方法的基本原理，了解方法可提供的信息；了解仪器的结构，方框图；掌握分析步骤和数据处理方法。,（1）质谱的原理：分子被离子化后，由于不同的离子质荷比（m/z）的差异，在能量相同的条件下，运动速度不同而将离子区分开来。（质量轻的离子比质量重的离子飞行速度快；质量相同的离子，具有高电荷状态的离子飞行的速度快）（2）质谱的主要组成部分：离子化源、质量分析系统、离子检测器和数据分析系统。一台质谱仪能否用于生物大分子的研究，关键在于离子化系统。,（3）生物大分子的离子化，对于大分子进行质谱分析，既要离子化又保证分子的完整性。过去采用电子碰撞的方法，分子多被撞成离子随片，难以进行分析。现在出现两种软电离的方法：一种是电喷雾离子化（ESI）法；另一种是基质辅助的激光解吸离子化（MALDI）法（4）肽序列的质谱测定采用串联质谱，可以得出肽段的氨基酸序列。,