TRPV1在炎症性肠病大鼠模型结肠黏膜的表达及其与肥大细胞相关性研究(定稿)[1].02.10.doc

TRPV1在炎症性肠病大鼠结肠黏膜的表达及其与肥大细胞相关性研究 穆敬平，刘莉，周立志，敖金波, 程建明，廖恒（湖北医药学院附属太和医院，湖北 十堰，442000）基金项目：湖北省教育厅项目（Q20102114）通讯作者：刘莉（1978- ）,E-mail：liulimjp摘要：目的：探讨炎症性肠病IBD大鼠模型肠黏膜TRPV1表达和肥大细胞的变化, 以及二者在IBD 发病机制中的作用。方法：将16只大鼠随机分为正常组和模型组，建立炎症性肠病大鼠模型。采用RT-PCR检测两组大鼠结肠黏膜TRPV1的mRNA表达, 免疫组化方法检测TRPV1蛋白表达和肥大细胞数量。结果：与正常组相比, IBD组肠黏膜中TRPV1mRNA 和蛋白过度表达, IBD组肠黏膜肥大细胞数显著高于对照组( P<0. 01)。正常对照组肠黏膜无或微弱阳性TRPV1表达。TRPV1蛋白及mRNA水平与肥大细胞数量之间呈正相关( r1= 0.528,r2=0.62，P<0.01)。结论：IBD的发生发展与TRPV1的过度表达及肥大细胞数量变化密切相关。关键词： 炎症性肠病；TRPV1；肥大细胞；相关性Related research between TRPV1 and mast cell in inflammatory bowel disease.Mu Jing-ping, Liu Li, Zhou Li-zhi, Ao Jin-bo, Cheng Jian-ming,Liao Heng.Taihe Hospital affiliated to Hubei Medical College, Shiyan, Hubei province ，442000Fund Project: Project of Hubei Provincial Department of Education (Q20102114) .Corresponding author: Liu Li (1978 -) . E-mail：liulimjp.Objective: To investigate the expression of TRPV1 expression and mast cell in IBD model，and the role in the pathogenesis of IBD.Methods: 16 rats were randomly divided into normal group and model group, established model of inflammatory bowel disease. TRPV1 mRNA of colon mucosa was examined by Semi-quantitative RT-PCR, TRPV1 protein expression and mast cells was examined by immunohistochemistry. Results: Compared with normal group, TRPV1mRNA and protein of IBD group was overexpressed, the number of intestinal mucosal mast cells of IBD group was significantly higher (P <0. 01). TRPV1 protein and mRNA levels and the number of mast cells was positively correlated ( r1= 0.528,r2=0.62，P<0.01). Conclusion:Over-expression of TRPV1 involved in the development of IBD and had closely related mast cells. Key words: inflammatory bowel disease; TRPV1; mast cell; correlation炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一类病因未明的肠道非特异性炎症, 具有慢性和消耗性的特征, IBD包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn's disease, CD)。IBD的发病机制尚未完全明确。目前大多学者认为肠壁黏膜免疫调节异常、持续肠道感染、肠壁黏膜屏障缺损、遗传和环境等因素共同参与该疾病的发生发展1-4. 肠黏膜免疫调节细胞和多种细胞因子参与免疫反应和炎症过程, 是当前关于IBD免疫发病机制的研究热点之一。近年来,发现肠粘膜肥大细胞(mast cell，MC)参与了IBD的致病过程5。IMMC释放的化介质,细胞因子与葡聚糖硫酸钠(dextran sulph sodiumsalt,DSS)诱导的结肠炎的粘膜损伤有关。最近有研究显示肥大细胞上的TRPV钙离子通道可能参与了肥大细胞的生物功能和病理过程。瞬时感受器辣椒素门控离子通道蛋白（TRPV1）最早发现于感觉神经元，被认为是各种伤害性刺激的分子整合器。TRPV1主要表达在初级传入感觉神经元上，是一种非选择性的阳离子通道。TRPV1可探测和整合炎症和热刺激信号，并转化为动作电位，并传至中枢形成痛觉。在胃肠道及相应背根神经节，TRPV1也有广泛分布。目前，已有诸多证据表明TRPV1可参与胃肠道运动，感觉和吸收等多种重要功能。这些生理学作用在功能性胃肠病的内脏高敏感和胃肠道运动失调的发病中有着重要意义。TRPV1可能为功能性胃肠病提供新的治疗靶点。在空肠和回肠中，TRPV1与肠道的运动与吸收有着密切的关系。本研究观察炎症性肠病大鼠结肠黏膜TRPV1的变化并与肥大细胞进行相关性研究，探讨结肠黏膜TRPV1与肥大细胞在炎症性肠病中的发病机制。1材料与方法1.1实验动物成年雄性SD大鼠16只，清洁级，体重(180±20)g由郧阳医学院动物实验中心提供（合格证号: SCKY(鄂)20050008）。所有动物购回后室温喂养一周，无不良反应，饮食饮水正常，纳入实验。随机分为正常组，模型组各8只。1.2主要试剂和仪器 2, 4, 6三硝基苯磺酸(2, 4, 6-trinitro-benzene-sulfonic acid, TNBS)购自Sigma公司。兔抗人TRPV1单克隆抗体（11000稀释，购自武汉博士德生物工程公司），即用型抗兔SABC试剂盒（武汉博士德生物技术公司），DAB显色试剂盒（北京中山生物技术公司）。Motic图像分析系统（购自麦克奥迪实业集团有限公司）。Masson染色试剂盒（上海仁宝医用试剂研究有限公司），二甲苯、甲醛（上海凌峰化学试剂有限公司），中性树胶（中国上海标本模型厂），石蜡包埋机（Tissue-Tek TEC日本樱花检验仪器株式会社），旋转石蜡切片机（LEICA RM 2235德国Leica公司），光学显微镜（BX51，日本Olympus公司）。1.3模型制备及分组应用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)，参照国际公认的Morris方法6，7，制备炎症性肠病大鼠模型。TNBS灌肠溶液制备：将5%的TNBS和50%的乙醇，按2：1比例混合成TNBS灌肠液。灌肠：各组大鼠灌注前24小时禁食、不禁水。大鼠称重后，20gL戊巴比妥钠20mgkg腹腔注射麻醉。造模大鼠以TNBS溶液100mgkg灌肠，正常组大鼠用相同体积的0.9氯化钠注射液灌肠。灌肠器插入肛门约68cm，注入灌肠液。大鼠体位为头朝下，拔出灌肠器后再倒立30秒左右，以防灌肠液溢出。每隔7d重复灌肠1次，共4次。正常组灌入同体积生理盐水。1.4 标本采集:大鼠禁食不禁水24 h, 腹腔注射100 g/L水合氯醛3 mL/kg, 麻醉后, 剖腹，. 游离结肠组织, 沿肠系膜纵轴剖开, 冰生理盐水清洗, 取病变最明显处组织2 cm放于40 g/L多聚甲醛液中固定, 石蜡包埋备用。1.5结肠TRPV1表达的检测: 采用免疫组化SABC法检测结肠黏膜TRPV1蛋白表达, 组织切片脱蜡; 将玻片置柠檬酸缓冲液中用微波炉进行抗原修复, 水洗; 30 g/L H2O2去离子水孵育10 min, 消去内源性过氧化物酶活性; 滴加100 g/L山羊血清室温下孵育15 min; 滴加1:1000浓度的羊抗大鼠TRPV1多克隆抗体4 过夜, PBS液冲洗; 滴加生物素化羊抗大鼠Ig抗体室温孵育15 min, PBS液冲洗; 滴加辣根酶标记的链酶亲和素室温孵育15 min, PBS液冲洗; DAB显色, 苏木素复染后, 封片观察。以PBS代替TRPV1一抗做阴性对照。显微镜下, 细胞质和细胞核内出现棕黄色或褐色颗粒为阳性反应物, 弥漫分布于黏膜固有层及部分上皮内。每张切片随机取5个视野，在400×倍下观察肠壁各层TRPV1着色情况。应用计算机病理图像分析系统image-pro plus 5.0，测定结肠TRPV1蛋白表达水平。1.6 结肠TRPV1mRNA检测:采用实时荧光定量RT-PCR: 根据GenBank中的相应序列, 以Primer Premier 5.0软件设计引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（见表1）。逆转录和PCR反应严格按照试剂盒操作说明进行: 10 L逆转录反应体系: 5×PrimeScriptTMBuffer 2 L, PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 0.5L, Oligo dT Primer 0.5 L, Random 6 mers 0.5L, Total RNA 2 L, RNase Free dH2O 4.5 L, 反应条件: 37 25 min, 85 1 min, -20保存备用. 20 L PCR反应体系中含SYBR® Premix ExTaqTM 10 L、正义和反义PCR引物(6 mol/L)各0.7 L、ROXTM Passive Reference Dye 0.4L、dH2O 6.2 L和模板mRNA 2 L, 反应条件:95 10 s; 95 5 s, 60 45 s, 共40个循环, 反应结束后, 由电脑自动分析计算出定量结果. 结果判断: 循环阈值(cycle threshold, Ct) =样品Ct均值-内参照Ct均值, Ct = Ct-(随机阴性对照样品Ct均值-该样品内参照Ct均值), 以2-Ct表示样品中目的基因初始cDNA相对表达量.表1 TRPV1引物探针序列基因 引物序列 产物长度(hn) 退火温度()GAPDH 上游引物 5'- CCGAGGGCCCACTAAAGG -3 120bP 60.27下游引物 5'- GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA3TRPV1 上游引物 5'- GGTGGACGAGGTAAACTGGA -3 131bP 60.01下游引物 5'- GCTGGGTGGCATGTCTATCT -31.7肥大细胞甲苯胺蓝染色肥大细胞采用甲苯胺蓝染色染成紫蓝色, 在40×10放大倍数下观察5个不重复视野, 观察范围为黏膜和黏膜下层, 取每个视野的平均数。 采用包埋法8处理肥大细胞后, 电镜下观察其脱颗粒现象.1.8 统计学处理 所有实验数据采用SPSS for Windows 16.0统计软件进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差（）表示，对数据作正态分布检验。数据符合正态分布，组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齐同时采用最小显著差法（Least significant difference，LSD）比较组间差异性，方差不齐时用Games-Howell比较组间差异性，P0.05作为差异有统计学意义。2 结果2.1大鼠结肠TRPV1免疫组织化学染色结果（图1-3）大鼠结肠黏膜TRPV1免疫组织化学染色结果显示，TRPV1阳性表达主要集中在黏膜层，可见胞浆及间质着色，呈棕黄色至深褐色。模型组大鼠在损伤的肠黏膜间质和增生的肉芽组织中有较强表达,阴性对照无特异性着色（见图1-3）。图1-3 各组大鼠结肠黏膜TRPV1免疫组织化学染色图1 正常组 （IHC 400×）图2 模型组 （IHC 400×） 图3 阴性对照 （IHC 400×）表 2 2组大鼠结肠黏膜TRPV1表达及TRPV1mRNA比较（）组别 n TRPV1阳性表达 TRPV1mRNA 正常组 8 6432.64±1300.95 0.7438±0.1335模型组 8 14003.42±3480.69* 1.0075±0.1902*注：与正常组比较，*P<0.05；*P<0.01. TRPV1阳性表达半定量结果显示，正常组TRPV1阳性表达明显低于模型组，经配对t检验，t=5.360，P =0.001，两组差异具有统计学意义（P<0.01）。两组TRPV1mRNA经配对t检验，t=4.291，P =0.004，两组差异具有统计学意义（P <0.01）。模型组无论是TRPV1蛋白表达水平还是TRPV1mRNA水平均高于正常组，提示炎症性肠病大鼠结肠黏膜TRPV1表达明显增强。2.2 结肠黏膜肥大细胞染色结果 模型组MC阳性细胞数（7.10±0.83）较正常组（4.26±0.93）明显增多，模型组结肠黏膜固有层可见较多脱颗粒MC，其细胞膜不完整，细胞形态不规则。表明MC处于激活状态，而正常组则罕见脱颗粒的MC。2.4 相关性分析 模型组结肠黏膜TRPV1蛋白表达水平及TRPV1mRNA水平均与结肠黏膜肥大细胞数量呈正相关(r 1= 0.528, r 2=0.62，均P<0.01)。3.讨论TRPV1为一种非选择性阳离子通道。在其基因序列中含有由25l4个核苷酸构成的可读框架，编码一种由838个氨基酸组成的蛋白质，相对分子质量为95×l0 。该蛋白具有6次跨膜结构，在第5和第6节段之间有一内嵌的发卡通道结构，其氨基端和羧基端都位于细胞内，N末端有3个锚蛋白结合位点，C末端具有瞬时感受器电位受体结构域9。推测TRPV1上可能存在3个蛋白激酶A磷酸化位点，它们在受体脱敏时发挥作用。TRPV1广泛表达于胃、空肠、回肠和结肠。TRPV1 广泛分布于脊髓背根及迷走神经的中、小神经元上以及一些非神经组织中如膀胱上皮、肝、胃肠道、肥大细胞等10,11。在回肠和结肠的炎症性疾病中，TRPV1通过蛋白激酶c、环磷酸腺苷依赖的蛋白激酶、磷酯酶等途径激活后出现表达显著上调和(或)致敏。因TRPV1的活化而触发神经递质的释放可部分解释炎症条件下小肠运动紊乱12。结肠中TRPV1的活化对于内脏高敏感的形成有着重要意义。在三硝基苯磺酸诱导的大鼠远端结肠炎模型中，胸腰部和腰骶部背根神经节神经元高表达的TRPVl除参与内脏高敏感性的形成外，也与结肠炎症的产生密切相关13。许多炎性介质和活性物质可影响TRPV1的表达和功能，如缓激肽、神经生长因子、前列腺素E2 、5-HT和ATP等14-15。这些炎性介质和活性物质可通过上调蛋白激酶活性导致TRPV磷酸化和受体敏感。Jones et al16研究报道，TRPV1基因敲除小鼠肠道传入神经纤维对炎症刺激引起的结肠敏感性降低，表明TRPV在内脏感觉信号传导和免疫调节方面起着关键作用。肠道炎症反应不仅参与诱导了内脏敏感性的形成和维持，而且也促进了TRPV1受体表达的上调17 。在慢性溃疡性结肠炎患者的肠黏膜上可发现增加的P物质阳性肥大细胞。通过释放类胰蛋白酶、组胺、肝素等促炎症介质或已合成或新合成的肥大细胞产物18，肥大细胞参与了溃疡性结肠炎的炎性反应19。溃疡性结肠炎中肥大细胞具有增高的分泌活性。增高的组胺和类胰蛋白酶水平强烈提示肥大细胞颗粒与炎症性肠病的发病机制有关。组胺是重要的介质，作用于Hl受体可使胃肠道平滑肌收缩和血管痉挛，除引起细胞水肿及血管通透性增加外，还可激活邻近的肥大细胞脱颗粒及促进类胰蛋白酶的释放。有研究表明，IBD发病过程中结肠黏膜MC释放的特异性介质的数量增高，从而诱导急慢性炎症，表明MC介质在UC炎症机制中有重要作用。肥大细胞在过敏原激发下释放IL一4就能促进Th2细胞亚群的增殖和发育20，伴有肥大细胞数量的改变。叶献词等21研究发现， MC数量随UC结肠病理程度加重而增多,并且与UC临床病情严重程度呈正相关。肥大细胞可通过其分泌的Tryptase激活肠黏膜上皮细胞或固有层炎性细胞PAR-2,将肥大细胞的脱颗粒信号放大,起信号级联反应,促进炎症介质的释放。肥大细胞脱颗粒参与了UC的炎症过程。本研究结果显示，炎症性肠病大鼠结肠黏膜TRPV1无论是蛋白表达水平还是mRNA水平均明显高于正常组，提示结肠黏膜TRPV1参与了肠道黏膜炎症反应的形成，TRPV1高表达是IBS发生的病理生理学机制之一。基于肥大细胞在炎症性肠病发病机制中的重要作用及其与结肠黏膜病理变化的相关性，本研究对TRPV1的表达与肥大细胞数量进行了相关性研究。结果提示结肠黏膜TRPV1无论是蛋白表达还是mRNA水平均与肥大细胞数量呈正相关，提示在炎症性肠病发病过程中，TRPV1高表达与MC活化有关。有研究显示，激活TRPV1可通过两种途径参与炎性反应：（1）使肥大细胞脱颗粒释放促炎和致痒性介质22；(2)使感觉神经纤维( 如C-纤维) 逆向释放神经多肽如P 物质和CGRP 而介导神经源炎症23,24。本研究结果提示TRPV1和肥大细胞介入了炎症性肠病的病理过程。但其具体机制尚需进一步的研究证实。参考文献1   Gismera CS, Aladrén BS. 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