《转基因动物》课件.ppt

,Transgenic Animals,Baiyan Wu,Department of Medical Genetics Peking University,80年代以来，分子生物学和哺乳动物胚胎工程学的迅速发展以及两个学科的互相渗透和联系，使基因可以在实验室条件下，从一个动物体内分离出来，进行增值修饰，再引入同种或异种动物胚胎中，并在个体发育中得到表达，形成转基因动物(Transgenic Animals)。转基因动物的产生实现了人们构建具有目的性状的动物的意愿。,一、转基因动物的概念,转基因动物（transgenic animal）:基因组中整合的外源基因能够表达的一类动物称为转基因动物。转基因首建者(transgenic founder):经过遗传操作的胚胎发育而来的基因组上整合有外源基因的动物。嵌合体动物(chimera animal):只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因的动物称为嵌合体动物。,二、转基因动物的研究概况,1949年Hammond报道了卵子在体外培养的方法.引发了一系列的胚胎体外操作实验胚胎工程学.1966年，Lin首次报道了显微注射方法.15年后才得到第一个转基因小鼠.1977年，Gurdon在用mRNA和DNA注射爪蟾卵的实验中观察到转移的核酸能发生作用。1980年，Brinster等用小鼠受精卵作了类似的实验.,1980年，Gordon 将SV40以及HSV的TK基因整合后的质粒，用显微注射法注入小鼠受精卵的雄原核内，首次成功地获得了转基因小鼠。1981年Constantini和 Wagner分别将家兔的-珠蛋白基因和人类-珠蛋白基因与疱疹病毒胸苷酸融合基因注射到小鼠受精卵的雄原核内，成功地获得了转基因小鼠。,1982年，Palmiter等将小鼠金属巯蛋白(MT)基因启动子片段和大鼠的生长激素（GH）基因的融合基因注入小鼠受精卵雄原核内，获得了超级小鼠“supermouse”,Brinsters growth hormone mouse,1985年Wagner等第一次使用逆转录病毒载体MMCV-neo感染ES细胞，用G418筛选转化细胞,制成嵌合体，以neo基因为探针检测，各分化组织中均有neo基因的表达。1986年，Robertson等用MPSVmos neo逆转录病毒载体转化ES细胞，首次通过ES 细胞途径获得转基因动物。,1987年，Thomas和Sapecchi等首次利用可以正负选择的靶载体，通过同源重组，造成了内源Hprt-基因的突变，获得了内源Hprt-的突变转基因小鼠，并确定了进行定位整合使用靶载体的基本原则。1990年，Pursel获得转小鼠乳清酸性蛋白(whey acidic protein,WAP）基因猪，基因在乳中表达了WAP。,1992年Swanson等将-1球蛋白和-球蛋基因导入山羊受精卵，得到转基因山羊中检测到人的血红蛋白。1993年，爱丁堡药用蛋白质有限公司报道了将抗胰蛋白酶基因注入羊受精卵，得到具有胰蛋白酶的羊，可提取胰蛋白酶用于肺气肿的治疗。同年，荷兰报道了将乳铁蛋白基因注入牛受精卵，得到的F1海尔曼公牛具有该基因，F2奶牛的奶中也含有这种蛋白。可用于治疗人类免疫衰退性疾病。,近年来通过转基因奶山羊，得到高产量生产抗-肿瘤坏死因子的抗体，用于风湿性和类风湿性关节炎的根治。2002年，Masaru Okabe 实验室成功建立了第一个应用RNAi的转基因小鼠。这种转基因小鼠体内能产生特异针对GFP的siRNA，可以在GFP转基因小鼠全身各个组织内敲低GFP的表达。,三、转基因动物的原理及应用,（一）转基因动物的基本原理（二）转基因动物技术的应用,（一）转基因动物的基本原理：,目的基因（或基因组片段）,显微注射等方法,受精卵或着床前胚胎细胞,移植,受体动物的输卵管（或子宫）,发育,分析转基因和动物表型的关系确定外源基因的功能,转基因动物（携带有外源基因）,培育品种优良的工程动物,（二）转基因动物技术的应用,1、研究基因的结构和功能2、研究发育过程中基因的特异性表达3、遗传性疾病的研究4、培育动物新品种5、构建转基因动物生物反应器,1、研究基因的结构和功能,1）组织特异性基因的表达。2）通过研究转入外源基因后的新表型，发现 基因的新功能。3）发现新的基因。导入外源基因后，由于基 因的随机插入，可能会导致内源基因的突 变，对这些突变进行表型分 析。4)建立研究外源基因表达、调控的动物模型。,2.研究发育过程中基因的特异性表达,外源基因或基因的调控元件进入动物体内后，对基因表达的时空特异性研究。研究只能在胚胎期才表达的基因的结构和功能。将不同外源基因转入宿主受精卵或早期胚胎干细胞，可观察目的基因在胚胎不同发育阶段的特异表达、关闭及调控机理。,3、遗传性疾病的研究,1）致病基因的研究 将致病基因或病毒基因导入动物，可研究 外源基因在宿主动物引起的病理变化，探讨发 病机理。2）建立遗传性疾病的转基因动物模型 这被认为是遗传学研究中继连锁分析、体 细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术。镰状细胞贫血、地中海贫血、高血压等3）探讨生殖细胞的基因治疗方法。,HBV转基因小鼠：对HBV基因在不同组织中表达及其表达产物的生物学效应分析，研究HBV在人体内的生活史和致病机理，进行乙肝药物的筛选。侏儒小鼠(dwarflit mice)：人生长激素缺陷I型模型，由生长激素等位基因隐性突变引起。高血压动物模型转基因猴“安迪”：导入了海蜇绿色荧光蛋白基因。,2001 The first pet was cloned.The kitten was named CC.Cats have a feline AIDS that is a good model for studying human AIDS,Phenotype of Ets2 transgenic mice,A progeroid syndrome in mice is caused by defects in A-type lamins,Nature,Vol 423,2003,a,b,c,d,het,hom,WT,heart,2 mm,myocytes,a,b,c,d,show smaller myocytes,WT,Mutant,a,e,h,g,f,WT,Mutant,Mouse Models of Obesity,已建立的遗传病转基因动物模型,疾病名称 转移基因 家族性淀粉状蛋白多发神经病变 突变人fransthyretin Lesch-Nyhan综合征 突变HPRT Downs综合征 CuZn-SOD Alzheimers 病 淀粉样蛋白 骨生成不完全 突变（1）胶原蛋白前体-1抗胰蛋白酶缺陷（肺气肿）突变人PiZ 1-抗胰酶 原发性高血压 小鼠Ren-2肾素基因 糖尿病I型 H-ras临基因；MHCI类抗原H-2kb 大鼠胰岛素II类抗原I-A,I-E 小鼠MHCI类抗原H-2kb 糖尿病II型 胰岛淀粉样多肽 镰状细胞贫血 人 和8globin；人2珠蛋白和8Antilles 人2珠蛋白和8 基因 人2和8珠蛋白基因-地中海贫血 人8基因,4、培育动物新品种,用转基因技术，把目的基因导入宿主动物，使转基因动物具有抗病、快速增长或增产某些特种蛋白等优良品质。例:转生长激素基因猪。,5.构建转基因动物生物 反应器（Bioreactor),用转基因动物生物反应器生产基因药物（肽类药物）。荷兰的生物医药公司用转基因牛生产乳铁蛋白；英国的罗斯林研究所研究成功的转基因羊，其乳汁中含有-抗胰蛋白酶,可治疗肺气肿。目前国际上利用转基因技术已能生产许多贵重药用蛋白。,anti-thrombin III(to treat intravascular coagulation)抗凝血酶IIIhuman blood clotting factors(VIII and IX)人凝血因子human interleukin-2collagen(to treat burns and bone fractures)胶原质fibrinogen(used for burns and after surgery),纤维蛋白原human fertility hormones,生长激素human hemoglobin,血色素human serum albumin(for surgery,trauma,and burns),人血清白蛋白lactoferrin(found in mother milk),乳铁蛋白tissue plasminogen activator,particular monoclonal antibodies(including one that is effective against a particular colon cancer),6、应用于人异种器官移植,通过转基因技术，克隆受体的补体调节蛋白基因，将这种基因转移到供体动物的基因组中，并在心血管内皮表达，避免受体的排斥反应。1993年英国培育了37头含有人体基因的猪，临床试验具有安全性。1999年，陈实将带有人类基因的猪心，移植到猕猴体内，也度过了排斥反应。,四、转基因动物的构建方法,（一）转基因技术（二）转基因动物的构建方法,（一）转基因技术,基因转移是指将目的基因导入到受体细胞的过程，它包括三方面的内容：目的基因、转化方法，受体细胞。根据不同的受体细胞选择不同的转化方法。,最原始的受体细胞是大肠杆菌,它作为受体细胞有以下优点：(1)生长迅速(2)容易操作(3)大规模繁殖快(4)对其质粒DNA的分子生物学背景清楚(5)表达调控研究比较全面,1、原核生物的基因转移,2、真核生物细胞的基因转移,要使外源基因在真核细胞内正确表达，首先要构建适当的表达系统，然后再转入细胞。方法：(1)磷酸钙沉淀法(2)EDAE葡聚糖转染法(3)电穿孔DNA转染法(4)逆转录病毒载体转染法(5)脂质体转化法,3、动物的转基因技术,逆转录病毒转导(Retrovirus-Mediation Transgenesis)原核显微注射(Pronuclear Microinjections)胚胎干细胞方法(Embryonic Stem Cell Method)精子介导法(Sperm Mediated Transfer),（1）显微注射技术,是采用显微注射仪对受精卵进行注射，将外源DNA直接注射到受精卵的原核中。最先由Gordon等人(1980)报道。随后Brister(1981)，Hogan(1986)和Allen(1987)作了更详细的描述。,Pronuclear injection,显微注射技术优点,1.实现基因导入的速度快且操作简单，对DNA大小无限制（最大达250Kb）。2.由于是将基因直接导入原核中，很少产生嵌合体，有利于对当代基因表达的分析，并能快速地建立转基因品系。,显微注射技术缺点：,1.需要特殊的仪器，包括倒置显微镜和显微 操纵仪，拉针仪等。还需要熟练的操作技术。2.由于DNA整合位点难以控制，而且整合拷贝数可从1几百个，无法作人为的控制。,（2）逆转录病毒载体技术,根据逆转录病毒cDNA能够整合到宿主细胞染色体内的这一特性，克隆、构建了多种逆转录病毒载体，通过转染的方式去实现生殖细胞的基因转移。,逆转录病毒进行基因转移，一般是将去掉透明带的早期胚胎（8细胞胚）和可产生病毒的成纤维细胞共培养，感染一定时间后，再进行胚胎移植。,逆转录病毒载体技术优点,1.能高效感染宿主细胞，感染率高；2.能稳定地整合到宿主细胞基因组中并传至后代细胞3.有广泛的宿主范围，对宿主细胞无毒性；4.载体容量较大，可插入78个kb的外源基因片段，其转化途径多是单一座位单拷贝，并在整合位点附 近不发生明显的重排；5.不需要显微注射器，操作简单。,逆转录病毒载体技术缺点：,1.整合率较低，不易用于受精卵，而多用于 感染早期胚胎和早期胚胎干细胞。2.由于胚胎是多细胞的，整合又是随机的，每个细胞的整合位置和数目不同，表达程度不一样，因此只能形成嵌合体，不能直接得到转基因动物。,（3）精子载体技术,1989年Lavitrano等首先报道了用精子作为载体，通过受精作用将外源基因引进受精卵这一方法用小鼠附睾内的精子作为载体，将DNA分子导入卵细胞，获得了转基因小鼠。据报道有30%的小鼠获得了外源基因的整合，并建立了转基因鼠系。,Brinster等(1989):实验方法完全与Lavitrano的相同.得到1300小鼠,经检测无一只为转基因小鼠.,1998 Maione等用小鼠精子与PSV2CAT共孵育 共75组 出生小鼠 转基因小鼠 转基因效率 1755只 130只 7.4%其中13组 366只 130只 36%其中5组 85%其中3组 100%其余62组 1389只 0 0,精子与DNA结合的调控机制,Lavitrano等(1989)与Horan等(1991)发现:只有活精子才可以吸收DNA,死精子没有这种能力。这似乎表明精子与DNA的相互作用与精子的代谢有关。用甲醛固定精子,破坏精子头部蛋白,发现精子不能吸收DNA,说明精子吸收DNA与其头部蛋白有关,是一种生理生化反应而不是一般的物理过程。,Camaioni等(1992)对精子吸附DNA的定位研究表明:DNA的主要作用部位是精子头部的赤道段和顶体后区.说明30-35KD蛋白分布于这两个区域.,(4)Embryonic stem cell technology,胚胎干细胞（ES细胞）是从着床前的动物胚胎中分离获得的一种多功能胚胎干细胞。把胚胎干细胞注射到动物囊胚后，可参与受体胚胎的构成，形成嵌合体，再通过繁殖，获得ES细胞后代。,胚胎干细胞技术优点：,外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。,ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体 目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。,胚胎干细胞技术缺点：,胚胎干细胞分为三大类,ECESEG或 PGCs,ES cells growing in culture,（二）转基因动物的构建方法,转基因动物的构建方法包括:显微注射法逆转录病毒法胚胎干细胞法精子载体法,小鼠ES细胞技术,ES细胞即早期胚胎干细胞(embryonic stem cell)。通过ES 细胞获得转基因动物的方法，在发育生物学、遗传学、医学等学科具有广泛的应用。,ES细胞的基因操作,ES细胞系建成后，人们考虑用ES细胞作基因操作。因为ES细胞在严格的生长条件下可以长期稳定的以细胞系形式维持生长。所以，可以象普通体细胞那样，通过各种手段如磷酸钙沉淀法，逆转录病毒感染或电穿孔等方法进行基因转化、筛选和克隆，由于ES细胞能够进行体外培养，所以做基因操作就比较容易。,实现基因的定位整合,在细胞内具有相似的核苷酸顺序的DNA 片段之间，可以相互配对并且发生交换，称为DNA的同源重组（Homologous recombination）。将细胞基因组的某一序列克隆并加以改造后，重新导入细胞中，这一序列就可以与基因组内的同源序列发生重组，从而将改造后的基因置换到基因组内，实现基因的定位突变，这一技术被形象地称为“基因打靶”（Gene targeting）。,1、基因打靶技术,基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。通过对生物活体遗传信息的定向修饰（基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因引入、染色体组大片段删除等），并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。,2、定位整合载体的构建,定位整合载体的组成：质粒骨架 筛选基因（标记基因）同源序列 定位突变的质粒载体又称靶载体（Targeting vector），构建靶载体的目的是要在目的基因的一个外显子中造成突变。,1、用置换型载体还是用插入型载体？2、打靶载体中带有多长的同源序列？3、用同系的DNA还是用非同系的DNA构建打 靶载体？4、用筛选方法还是用富集方法获得中靶的 ES细胞？,构建一个打靶载体要考虑几个问题,置换型载体,置换型载体，其基本元件是与靶位点两侧同源的同源序列臂、正筛选标记基因、质粒序列、同源臂外侧的线性化位点。重组的结果是：载体中的同源序列与靶基因间发生两次交换，靶基因序列被把载体上同源臂与同源臂间的序列所代替，而载体末端的非同源序列被切除。,G418,neo,neo,打靶载体,x,x,打靶后的基因,打靶基因,置换型重组,插入型载体,插入型载体又称O型载体，在打靶过程中，整个载体序列通过同源重组插入到基因组序列中，使靶基因产生突变。插入型载体的基本结构元件与置换型载体类似。但它的线性化位点在同源序列内部，靶载体与靶位点之间经过1次交换将载体插入到靶基因组序列中，从而使同源序列“复制”了1倍。,插入型载体与置换型载体相比打靶效率高5-10倍，但由于插入型载体在打靶时有许多拓扑构型，因此人们更倾向于使用置换型载体。,筛选基因（标记基因）,正筛选基因：转化子存活，非转化子死亡 neo-G418（与新霉素相关的氨基糖苷）这种选 择系统适用于所有细胞类型负筛选基因：定位转化子存活，随机转化死亡 HSV-tk GANC 或 FIAU（病毒的胸腺嘧啶激酶基因）(毒性核苷酸类似物）双向选择基因：用于Hprt(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）的ES细胞 Hprt+细胞在HAT培养基中存活 Hprt 细胞在6-TG培养基中存活,正筛选基因的方法通常是插入一个能够在ES细胞中表达的neo基因（新霉素抗性基因）。这样不但在基因中造成了插入突变，而且可以利用筛选培养基G418来筛选转化细胞，检测是否存在选择标记基因，判定打靶载体是否整合到基因组中。,负筛选基因,一般选择HSV-tk 基因作为负筛选基因，这样可以在正选择标记筛选的基础上再富集同源重组克隆35倍。,neo,1,2,lacZ,tk,3,IREs,正负选择载体的基本结构,正负双向选择载体,3、细胞的转化,得到构建的靶载体后，即可以进行ES细胞的转染。用前要用BstE II酶将靶载体线性化。把外源目的基因和具有标记neo基因的重组的病毒载体，用适当的方法使这个重组体转化ES细胞。然后，把这些ES细胞培养在具有G418的培养基中，经过一段时间，未被转化的ES细胞，因无neo基因，都被G418杀死，留下来的都是被导入neo基因的ES细胞。当然这些转化细胞也具有外源目的基因了。,4、定位整合的检测,（1）Southern 印迹法 基因发生突变后，其限制性内切酶片段长度将有所改变，因此用特定限制性内切酶消化ES细胞的基因组DNA，进行Southern印迹杂交分析，可以通过比较杂交片段长度的变化判断定位整合事件的有无。（2）PCR 法 聚合酶链式反应法也可以检出定位转化子。,（三）具有遗传标记的ES细胞嵌 合体建立及转基因小鼠的获得,把上述转化的ES细胞通过显微注射，注入宿主囊胚的囊胚腔中，并参与宿主囊胚内细胞团的发育，在假母子宫内形成嵌合体胎儿。出生后的嵌合体，经杂交可获得种系嵌合体即转目的基因小鼠。（以毛色标记为例）,blastocysts,Injection of EScells into blastocysts,Successfully transformed ES cells are injected into blastocysts,Retrieval of Blastocysts,Littermates,Black mouse-no apparent ES cell contribution,Chimeric founder-strong ES cellcontribution,Chimeric founder-weaker ES cellcontribution,Thank you！,