生化大实验双向琼脂免疫扩散.ppt

双 向 免 疫 扩 散 试 验,纯度检测方法二：,一实验目的,学习双向免疫扩散实验原理掌握双向免疫扩散实验操作方法,基本概念,抗原：抗原（antigenicity）是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗体：抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。,二 实验原理,双向免疫扩散是一种定性试验。将抗原、抗体分别加入琼脂板相对应的小孔中，使两者互相扩散，在比例适当处形成可见的沉淀线。观察沉淀线的位置、数量、形状，以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析，常用于:（1）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行初步估算。（2）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗体）（3）抗原或抗体相对分子量的估计双向免疫扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排孔型、梅花孔型（见图1）,图1 双向免疫琼脂扩散孔型,三孔型,双孔型,梅花孔型,双排孔型,三 试剂与器材,1.缓冲液：4.65gTris加水溶解，加115ml 0.1 M HCl，最后补水至1000ml，pH为8.2。2.凝胶液：5g琼脂糖加500ml上述缓冲液，微波炉加热煮沸溶解。注意用中小火，以免暴沸。3.待测样品：I号峰、II号峰、III号峰4.羊抗人IgG抗体、羊抗人LDL抗体、羊抗人apoA-I抗体。5.生化培养箱、微波炉、刻度吸管、培养皿、下口径2mm滴管等,四 操作步骤,1.制板：用移液管吸取热琼脂20ml，平铺于直径9cm培养皿中。2.打孔：待琼脂凝固后，按图1梅花孔型打孔，孔径2mm,孔与孔距离3-4mm。用针挑去孔内琼脂。3.用微量加样器将羊抗人IgG抗体、羊抗人LDL抗体及羊抗人apoA-I抗体各5-10ul加入周边孔中，中间孔加不同峰的液体。4.将培养皿置于生化培养箱内，于37温育，隔天观察结果。,五 注意事项,1.用琼脂浇培养皿时，培养皿必须保持水平位置。2.每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被加满，又必须不使样品溢出孔外。3.打孔时注意不要将孔弄破。,六 复习题,1.什么是抗原？2.什么是抗体？3.双向免疫扩散的原理及应用。,