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真核生物的启动子有其特殊性，真核生物有三种RNA聚合酶，每一种都有自己的启动子类型。以RNA聚合酶的启动子结构为例，人们比较了上百个真核生物RNA聚合酶的启动子核苷酸序列伯发现；在-25区有TATA框，又称为Hogness框或Goldberg-Hogness框。其一致序列为T28A97A93A85A63T37A83A50T37，基本上都由A，T碱基所组成，实验表明，TATA框决定了转录起点的选择，天然缺少TATA框的基本可以从一个以上的位点开始转录。在-75区有CAAT框，其一致的序列为GGTCAATCT。有实验表明CAAT框与转录起始频率有关。三）原核基因转录的起始原核生物转录起始可分为四个阶段：核心酶在因子参与下接触到DNA上；RNA聚合酶识别启动子并与之结合，形成封闭性的起始复合物；酶结合在-10区，启动子活化；然后解开双链，暴露模板链；酶移动到转录起始位点，加上第一个核苷三磷酸，形成三元复合物，转录开始。,四）真核基因转录的起始真核生物转录起始十分复杂，往往需要多种蛋白因子的协助，已经知道，在所有的细胞中有一类叫做转录因子的蛋白质分子，它们与RNA聚合酶形成转录起始复合物，共同参与转录起始的过程。真核生物基因中，有专门为蛋白质编码的基因，这些基因由RNA聚合酶负责进行转录起始关键性作用。根据这些转录因子的作用特点可大致分为二类；第一类为普遍转录因子，它们与RNA聚合酶共同组成转录起始复合物，转录才能在正确的位置上开始。普遍转录因子是由多种蛋白质分子组成的，其中包括特异结合在TATA盒上的蛋白质，叫做TATA盒结合蛋白，还有至成一组复合物叫做转录因子D。TFD再与RNA聚合酶结合完成转录起始复合物的形成。除TFD以外，在细胞核提取物中还发现TFA，TFF，TFE，TFH等，它们在转录起始复合物组装的不同阶段起作用，像TFH就有旋转酶活性，它可利用ATP分解产生的能量，介导起始点双螺旋的打开，使RNA聚合酶得以发挥作用。从中也不难看出真核细胞中基因转录的起始是基因的表达调控的关键，这么多蛋白质分子之间相互作用，以及这些蛋白质分子DNA调控元件相结合，构成控制基因转录开始的复杂体系。第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子或者叫可诱导性转录因子，这此TF是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素，生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时，才需要的一类转录因子。,一）原核生物mRNA的特征,1 原核生物的mRNA半衰期短2 许多原核生物mRNA以多顺反子的形式存在3 原核生物mRNA5端无帽子结构，3端没有或只有较短的poly(A)结构。原核生物中，mRNA的转录和翻译不仅发生在同一个细胞空间里，而且这两个过程几乎是同步进行的，蛋白质合成往往在mRNA刚开始转录是被引发了。一个原核细胞的mRNA(包括病毒)有时可以编码几个多肽，而一个真核细胞的mRNA最多只能编码一个多肽。,1 半衰期较长，几乎都是单顺反子的形式存在2 真核生物的mRNA的5端存在帽子结构。帽子结构可能使mRNA免遭核酸酶的破坏。mRNA的帽子结构常常被甲基化3 绝大多数真核生物mRNA具有poly(A)尾巴真核细胞mRNA的最大特点在于它往往以一个较大分子质量的前提RNA出现在核内，只有成熟的，相对分子质量明显变小并经化学修饰的mRNA才能进入细胞质，参与蛋白质的合成。所以，真核细胞的mRNA的合成和功能表达发生在不同的空间和时间范筹内。,二）真核生物mRNA的特征,3.4 原核生物与真核生物mRNA的特征比较,一 RNA中的内含子,断裂基因：断裂基因的存在表明真核细胞的基因结构和mRNA合成过程比原核细胞要复杂的多，因为真核基因的表达往往伴随着RNA的剪接过程，从mRNA前体分子中切除被称为内含子的非编码区，并使基因中被称为外显子的编码区拼接形成成熟mRNA。真核基因大多是断裂的，也就是说一个基因可由多个内含子和外显子间隔排列而成。外显子：编码蛋白质的序列。内含子：初级转录产物hnRNA加工产生成熟mRNA时被切除的间隔序列。研究表明，内含子在真核基因中所占的比例非常高，甚至超过99%。,3.5 内含子的剪接编辑及化学修饰,研究表明，许多相对分子质量较小的核内RNA以及与 这些RNA相结合的核蛋白(被称为snRNPs)参与RNA的 剪接。mRNA链上每个内含子的5和3段分别与不 同的snRNPs相结合，形成RNA和RNP复合物。在高等真核生物中，内含子通常是有序或组成性地从 mRNA前体中被剪接，然而，在个体发育或细胞分化 时可以有选择地越过某些外显子或某个剪接点进行变 位剪接，产生出组织或发育阶段特异性mRNA，称为 内含子的变位剪接。一般情况下，由u1snoRNA以碱基互补的方式识别mRNA前体5剪接点，由结合在3剪接点上游富嘧啶区的u2AF识别3剪接点，并引导u2snRNP与分支点相结合，形成剪接前体，并进一步与 u4、u5、u6snRNP三聚体相结合，形成60s的剪接体，进行RNA前体分子的剪接。,二 RNA的剪接,原核生物的结构基因是连续编码序列，而真核生物基因往往是断裂基因，即编码一个蛋白质分子的核苷酸序列被多个插入片断所隔开，一个真核生物结构基因中内含子的数量，往往与这个基因的大小有关，例如胰岛素是一个很小的蛋白质，它结构基因只有两个内含子，而有些很大的蛋白质，它的结构基因中可以有几十个内含子。经过复杂的过程后，切去内元，将有编码意义的核苷酸片段（外显子）连接起来（图）,RNA的编辑是某些RNA，特别是mRNA的一种加工方式，它导致了DNA所编码的遗传信息的改变，因为经过编辑的mRNA的序列发生了不同于模版DNA的变化RNA的编辑可能是充分发挥生理功能所必须的。载体蛋白mRNA中的C-U,谷氨酸受体蛋白mRNA中的A-I，都属于脱氨基作用的结果，分别由胞嘧啶和腺嘌呤脱氨酶所催化。通常情况下，该酶促反应的特异性不强，腺嘌呤脱氨酶可以作用于双链RNA区的任何腺苷酸残基。但是，RNA的编辑发生在带有催化作用的脱氨酶亚基的复合体中，有附加的RNA结合区能帮助识别所编辑的特异性靶位点。除了RNA的编辑之外，有些RNA，特别是前体rRNA和tRNA，还可能有特异性化学修饰如下：,三 RNA的编辑和化学修饰,蛋白质的生物合成步骤,蛋白质的合成是一个比DNA的复制和转录更为复杂的过程。它包括：(1)翻译的起始 核糖体与mRNA结合并与氨酰-tRNA生成起始复合物。(2)肽链的延伸 由于核糖体沿mRNA5端向3端移动，开始了从N端向C端的多肽合成，这是蛋白质合成过程中速度最快的阶段。(3)肽链的终止及释放 核糖体从mRNA上解离，准备新一轮合成反应。核糖体是蛋白质合成的场所。mRNA是蛋白质合成的模板。转移RNA(transfer RNA，tRNA)是模板与氨基酸之间的接合体。,第四章 生物信息的传递（下）,在合成的各个阶段有许多蛋白质、酶和其他生物大分子参与。参与蛋白质合成的各种组分约占细胞干重的35%。在真核生物中有将近300种生物大分子与蛋白质的生物合成有关。蛋白质合成是一个需能反应，要有各种高能化合物的参与。细胞用来进行合成代谢的总能量的90%消耗在蛋白质合成过程中。在真核生物细胞核内合成的mRNA，要运送到细胞质，才能翻译生成蛋白质。所谓翻译是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。蛋白质合成速度很高。大肠杆菌只需要5s就能合成一条由100个氨基酸组成的多肽。,蛋白质合成的生物学机制,蛋白质是生物活性物质中最重要的大分子组分，生物有机体的遗传学特性要通过蛋白质来得到表达。蛋白质的生物合成包括氨基酸活化、肽链的起始、伸长、终止以及新合成多肽链的折叠和加工。（1）氨基酸的活化：蛋白质合成的起始需要核糖体大小亚基、起始tRNA和几十个蛋白因子。在mRNA编码区5端形成核糖体-mRNA-起始tRNA复合物并将甲硫氨酸放入核糖体P位点。（2）翻译的起始：细菌中翻译的起始需要如下7种成分:30S小亚基，模板mRNA，fMet-tRNAfMet，3个翻译起始因子(IF-l、IF-2和IF-3)，GTP，50S大亚基，Mg2。翻译起始又可被分成3步。第一步，30S小亚基与翻译起始因子IF-l，IF-3的作用下通过mRNA 的SD序列与之相结合。第二步，在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。第三步，带有tRNA、mRNA及3个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合；然后，释放翻译起始因子。,（3）肽链的延伸：当第一个氨基酸与核糖体结合以后，按照mRNA模板密码子的排列，氨基酸通过新生肽键的方式被有序地结合上去。每加一个AA是一个循环，每个循环包括AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位。（4）肽链的终止：肽链在延伸过程中，当终止密码子出现在核糖体的A位时，没有相应的AA-tRNA能与之结合，而释放因子能识别终止密码子并与之结合，水解P位上多肽链与tRNA之间的酯键。新生的肽链和tRNA从核糖体上释放，核糖体解体，蛋白质合成结束。释放因子RF催化GTP水解促使肽链与核糖体解离。（5）蛋白质前体的加工：新生多肽链大多数是没有功能的，必须经过加工修饰才能转变为有活性的蛋白质。1N端fMet或Met的切除；2二硫键的形成 二硫键是蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化作用生成的。3特定氨基酸的修饰 氨基酸侧链的修饰包括磷酸化(如核糖体蛋白质)、糖基化(如各种糖蛋白)、甲基化(如组蛋白、肌肉蛋白质)、乙基化(如组蛋白)、羟基化(如胶原蛋白)和竣基化等。,蛋白质运转机制,蛋白质的合成位点与功能位点常常被细胞内的膜所隔开，蛋白质需要运转。核糖体是真核生物细胞内合成蛋白质的场所，任何时候都有许多蛋白质被输送到细胞质、细胞核、线粒体和内质网等各个部分，补充和更新细胞功能。细胞各部分都有特定的蛋白质组分，蛋白质必须准确无误地定向运送才能保证生命活动的正常进行。蛋白质运转可分为两大类:1、翻译运转同步机制：蛋白质的合成和运转同时发生，则属于;2、翻译后运转机制：蛋白质从核糖体上释放后才发生运转。分泌蛋白质大多是以同步机制运输的。在细胞器发育过程中，由细胞质进入细胞器的蛋白质大多是以翻译后运转机制运输的。参与生物膜形成的蛋白质，依赖于上述两种不同的运转机制镶入膜内。,1 翻译-运转同步机制,分泌蛋白的生物合成开始于核糖体，翻译到大约50个氨基酸残基，信号肽开始从核糖体的大亚基露出，被内质网膜上的受体识别并与之结合。信号肽过膜后被内质网腔的信号肽酶水解，新生肽随之通过蛋白孔道穿越疏水的双层磷脂。当核糖体移到mRNA的“终止”密码子，蛋白质合成即告完成，翻译体系解散，膜上的蛋白孔道消失，核糖体重新处于自由状态。蛋白质定位的信息存在于该蛋白质自身结构中，并且通过与膜上特殊受体的相互作用得以表达。信号肽紧接在起始密码之后，大部分是疏水氨基酸。信号肽的长度在1336个残基。信号肽的特点：1、1015个疏水氨基酸；2、N端有带正电荷的氨基酸；3、C端接近切割点处代数个极性氨基酸；4、C端氨基酸侧链短。2 翻译后运转机制 叶绿体和线粒体中有许多蛋白质和酶是由细胞质提供的，其中绝大多数以翻译后运转机制进入细胞器内。,2.1 线粒体蛋白质跨膜运转,特征:1、通过线粒体膜的蛋白质在运转之前大多数以前体形式存在，它由成熟蛋白质和位于N端的一段前导肽(leader peptide)共同组成,前导肽约含2080个氨基酸残基，当前体蛋白过膜时，前导肽被多肽酶所水解，释放成熟蛋白质。2、蛋白质通过线粒体膜运转时，首先由外膜上的Tom受体复合蛋白识别与分子伴侣相结合的待运转多肽，通过Tom和Tim组成的膜通道进入线粒体内腔。蛋白质跨膜运转时的能量来自线粒体Hsp70引发的ATP水解和膜电位差。2.2 前导肽的作用与性质拥有前导肽的线粒体蛋白质前体能够跨膜运转进人线粒体，在这一过程中前导肽被水解，前体转变为成熟蛋白，则失去继续跨膜能力。因此，前导肽对线粒体蛋白质的识别和跨膜运转起着关键作用。前导肽具有如下特性:带正电荷的碱性氨基酸(特别是精氨酸)含量较为丰富，它们分散于不带电荷的氨基酸序列之间;缺少带负电荷的酸性氨基酸；羟基氨基酸(特别是丝氨酸)含量较高;有形成两亲(既有亲水又有疏水部分)-螺旋结构的能力,3 核定位蛋白的运转机制,蛋白质一般通过核孔进入细胞核。核糖体蛋白首先在细胞质中合成，运转到细胞核内，在核仁中被装配成40S和60S核糖体亚基，然后运转回到细胞质中去合成蛋白质合成。RNA、DNA聚合酶、组蛋白、拓扑异构酶及大量转录、复制调控因子都必须从细胞质进入细胞核才能正常发挥功能。在多细胞真核生物中，每当细胞发生分裂时，核膜被破坏，等到细胞分裂完成后，核膜被重新建成，分散在细胞内的核蛋白必须被重新运入核内，因此，为了核蛋白的重复定位，这些蛋白质中的信号肽被称为核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)一般都不被切除。NLS可以位于核蛋白的任何部位。蛋白质向核内运输的过程蛋白质向核内运输过程需要核运转因子、和一个GTP酶(Ran)。和组成的异源二聚体是核定位蛋白的可溶性受体，与核定位序列相结合的是亚基。由上述3个蛋白组成的复合物停靠在核孔处，依靠Ran GTP酶水解GTP提供的能量进入细胞核，和亚基解离，核蛋白与亚基解离，和分别通过核孔复合体回到细胞质中，起始新一轮蛋白质运转。,4 蛋白质的降解,生物体内蛋白质的降解过程是一个有序的过程。当细胞中出现错误的蛋白质或半衰期很短的蛋白质时，蛋白酶被激活。蛋白质的半衰期大约从30s到许多天不等。像血红蛋白这样少数蛋白的半衰期与细胞周期同样长(成红细胞110天)。成熟蛋白N端的第一个氨基酸(除已被切除的N端甲硫氨酸之外，但包括翻译后修饰产物)在蛋白的降解中的影响很大。当某个蛋白质的N端是甲硫氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸时，表现稳定。其N端为赖氨酸、精氨酸时，表现最不稳定，平均2-3min就被降解了。,甲基化：在核苷酸或核糖基上加一个或多个-CH3。举例：鸟嘌呤甲基化产物MTG去氨基化：从碱基上去掉氨基。举例：鸟嘌呤去氨基后成为次黄嘌呤。硫代：用硫代取代碱基分子上的氧。举例：4-硫脲嘧啶。碱基的同分异构化：碱基环结构上发生分子替代。举例：脲嘧啶同分异构化生成假脲嘧啶。二价键的饱和化把一个二价键饱和。举例：二氢脲嘧啶。核苷酸的替代：用不常见核苷酸替换常见核苷酸，举例：荃嘧啶DNA甲基化可能存在于所有高等生物中并与基因表达调控密切相关，DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色体结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。,第六章 原核基因表达调控基因表达调控主要表现在以下几个方面：转录水平上的调控(transcriptional regulation)；mRNA加工成熟水平上的调控(differential processing of RNA transcript)；翻译水平上的调控(differential translation of mRNA).原核生物中，营养状况(nutritionalstatus)和环境因素(environmental factor)对基因表达起着举足轻重的影响。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormone level)和发育阶段(developmental stage)是基因表达调控的最主要手段，营养和环境因素的影响力大为下降。,1、真核与原核基因组结构差异,真核：真核基因组结构庞大:如人类细胞单倍体基因组就包含3109bpDNA，约为大肠杆菌总DNA的800倍单顺反子基因不连续性:断裂基因（interrupted gene）、内含子(intron)、外显子(exon)非编码区较多 多于编码序列(9:1)含有大量重复序列原核：基因组很小，大多只有一条染色体 结构简炼 存在转录单元多顺反子 有重叠基因,第七章 基因的表达与调控(下),真核生物基因调控可分为两大类：第一类是瞬时调控或称可逆性调控，它相当于原核生物细胞对环境条件所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降时，或细胞周期不同阶段中酶活性的调节；第二类是发育调控或称不可逆调控，使真核基因调控的精髓部分，它决定真核细胞生长分化发育的全部进程。,二、真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面存在以下几个方面的差异,在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，很少存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。真核细胞DNA与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。在真核生物中，基因转录的调节区相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5上游区DNA构型来影响RNA聚合酶与它的结合。在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑制RNA聚合酶与它的结合。真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程，才能顺利地翻译成蛋白质。,增强子、特点、作用原理增强子是指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。增强子特点：增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍 增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（53或35），甚至和靶基因相距3kb，或在靶基因下游，均表现出增强效应；大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），该序列是产生增强效应时所必需的；增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明增强子只有与特定的蛋白质（转录因子）相互作用才能发挥其功能；没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应；许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。,作用原理：增强子可能有以下三种作用机制：影响模版附近的DNA双螺旋结构，导致DNA双螺旋弯折或在反式因子的参与下，以蛋白质之间的相互作用为媒介形成增强子与启动子之间“成环”连接，活化基因转录；将模版固定在细胞核内特定位置，如连接在核基质上，有利于DNA拓扑异构酶改变DNA双螺旋结构的张力，促进RNA聚合酶在DNA链上的结合和滑动；增强子区可作为反式作用因子或RNA聚合酶进入染色质结构的“入口”7.4 真核基因转录调控的主要模式细胞除通过DNA复制和随后的细胞分裂将本身所固有的遗传信息由亲代传至子代，它们还不断地“感知”环境的各种变化，并对其作出特有的应答。细胞应答可分为三个阶段：外界信息的感知，既由细胞膜到细胞核内的信息传递；染色质水平上的基因活性调控；特定基因的表达。,4.1 蛋白质磷酸化、信号传导及基因的表达蛋白质磷酸化与去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传导方式，几乎涉及所有的生理及病理过程。细胞表面受体与配体分子的高亲和力特异性结合，能诱导蛋白构想变化，使细胞外信号顺利通过质膜进入细胞内，或是受体发生寡聚化而被激活。一般情况下，受体分子活化细胞功能的途径有两条：一是受体本身或受体结合蛋白具有内源酪氨酸激酶活性，胞内信号通过酪氨酸激酶途径得到传递；二是配体与细胞表面受体结合，通过G蛋白介导的效应系统产生介质，活化丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸激酶，从而传递信号。4.2 激素及其影响 许多类固醇激素（如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮激素和雄激素）以及一般代谢性激素的调控都是通过启动基因转录而实现的。靶细胞具有专一的细胞受体，可与激素形成复合物，导致三维结构甚至化学性质的变化。经修饰的受体与激素复合物通过核膜进入细胞核内，并与染色质的特定区域相结合，导致基因转录的起始或关闭许多类固醇激素（如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮激素和雄激素）以及一般代谢性激素的调控都是通过启动基因转录而实现的。三种假说：受体流动假说、中介物假说、邻位互调假说。,热激蛋白诱导的基因表达,1 基因工程与基因治疗的差别基因工程是将具有应用价值的基因，即“目的基因”，装配在具有表达元件的特定载体中，导入相应的宿主如细菌、酵母或哺乳动物细胞中，在体外进行扩增，经分离、纯化后获得其表达的蛋白产物。基因治疗是将具有治疗价值的基因，即“治疗基因”装配于带有在人体细胞中表达所必备元件的载体中，导入人体细胞，直接进行表达。可大大降低治疗成本。因为基因治疗不需要基因工程中耗资最大的器材与材料费用，显著降低了工业化的成本。基因工程的“目的基因”主要是可分泌蛋白，如生长因子、多肽类激素、细胞因子、可溶性受体等，对于非分泌性蛋白质，由于它们往往不能有效地进入细胞而不能被应用于基因工程。但基因治疗不受上述限制。几乎所有的基因，只要它具有治疗作用，理论上均可应用于基因治疗。因此，基因治疗具有更大的潜力。基因工程的操作全部在体外完成，基因治疗则必须将基因直接导入人体细胞。这不仅在技术上具有很大的难度，而且在安全性与有效性方面提出了更为苛刻的要求。基因工程已经有三四十年的历史，技术已比较成熟；基因治疗仅有十多年的历史，不少技术还不够成熟。所以，它遇到的风险更大。,2 基因治疗的概念和策略基因治疗(gene therapy)就是用正常或野生型(wild type)基因矫正或置换致病基因的一种治疗方法。在这种治疗方法中，目的基因被导入到靶细胞（target cells）内，它们或与宿主细胞（host cell）染色体整合成为宿主遗传物质的一部分，或不与染色体整合而位于染色体外，但都能在细胞中得到表达，起到治疗疾病的作用。目前基因治疗的概念了较大的扩展，凡是采用分子生物学的方法和原理，在核酸水平上开展的疾病治疗方法都可称为基因治疗。随着对疾病本质的深入了解和新的分子生物学方法的不断涌现，基因治疗方法有了较大的发展。根据所采用的方法不同，基因治疗的策略大致可分为以下几种：基因置换（gene replacement）：基因置换就是用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。这种治疗方法最为理想，但目前由于技术原因尚难达到。基因修复（gene correction）：基因修复是指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。这种基因治疗方式最后也能使致病基因得到完全恢复，操作上要求高，实践中有一定难度。基因修饰（gene augmentation）又称基因增补，将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内，目前基因治疗多采用这种方式。如将组织型纤溶酶原激活剂的基因导入血管内皮细胞并得以表达后，防止经皮冠状动脉成形术诱发的血检形成。,基因失活（gene inactivation）：利用反义技术能特异地封闭基因表达特性，抑制一些有害基因的表达，已达到治疗疾病的目的。如利用反义RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化。用此技术还可封闭肿瘤细胞的耐药基因的表达，增加化疗效果。免疫调节（immune adjustment）：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入疾人体内，改变病人免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。如将白细胞介素-2导入肿瘤病人体内，提高病人IL-2的水平，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤复发的目的。其它：增加肿瘤细胞对放疗或化疗的敏感性：采用给予前体药物的方法减少化疗药物对正常细胞的损用力。如向肿瘤细胞中导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，然后给予病人无毒性GCV药物，由于只有含HSV-TK基因的细胞才能将CGV转化成有毒的药物。因而肿瘤细胞被杀死，而对正常细胞无影响。,3 基因治疗的基本程序（1）目的基因的选择和制备：可用于基因治疗的基因需满足以下几点：在体内仅有少量的表达就可显著改善症状；该基因的过高表达不会对机体造成危害。在确定欲选目的基因后，就要制备目的基因。正向表达的基因可以是cDNA，也可是基因组DNA片段。可用传统的方法获取，也可采用多聚酶链式反应(PCR)等新技术进行体外扩增。部分反义基因也可采用此法获得，但多数情况下采用人工合成的方式制备（2）基因的转运 目前已有多种基因转运的方式，其基本原则是将外源基因运到细胞内。已使用的有病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体：病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解；RNA病毒能整合到染色体以及基因水平较高等。因此病毒载体是良好的基因转运载体。目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关的病毒、疱疹病毒和肝炎病毒等。逆转录病毒用作载体时需进行几步改造：A：将天然的野生型RNA前病毒转变成DNA载体，并插入欲转移的相关外源基因。其基本原则是用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因。B：制备辅助细胞为载体DNA提供其丧失的功能 C：将载体DNA导入辅助以产生病毒载体。D：病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表达。,（3）靶细胞的选择 理论上讲，无论何种细胞均具有接受外源DNA的能力，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，而只能使用体细胞，用于转基因的体细胞必须取材方便，含量丰富，容易培养，寿命较长。可选择的细胞有淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌肉细胞和肿瘤细胞等。在实际上应用中应具体根据目的条件选择。（4）细胞转染（tansfection）将目的基因导入靶细胞的方法很多，大致可分为物理学方法、化学方法、融合法和病毒感染法四类。病毒法已在本节的“基因的转运”中有基因介绍。目前较多使用的是脂质体法。（5）外源基因的表达及检测 在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标记基因表达的鉴定。常用方法有原位杂交，Northrn杂交，NRA打点杂交，免疫组织化学染色等，前几项是检测外源基因转录出的mRNA，后者则是检测外源基因翻译出的蛋白质。流式细胞仪是一种较为客观准确的仪器，可定量分析外源基因的表达状况。,4 基因治疗的两大途径基因治疗的两条主要途径：即 ex vivo 与 in vivo 方式 ex vivo 途径 这主要是将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞，这种细胞被称为“基因工程化的细胞”，经体外细胞扩增后输回人体。这种方法易于操作，不易产生副作用，安全性好。但是，这种方法不易形成规模，而且必须有固定的临床基地。In vivo 这是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体上，直接导入人体内。这种方式非常有利于大规模工业化生产。但是，对这种方式导入的治疗基因以及其载体必须证明其安全性，而且导入人体之后必须能进入靶细胞，有效的表达并达到治疗的目的。因此，在技术上要求很高，其难度明显高于上一种模式。用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件：携带外源基因并能装配成病毒颗粒；介导外源基因的转移和表达；对机体没有致病力。因为大多数野生型病毒对机体都具有致病性，需要对其进行改造后才能被用于人体。到目前为止，只有少数几种病毒如反转录病毒、腺病毒及腺病毒伴随病毒、疱疹病毒等被成功的改造成为基因转移载体。,基因治疗中的问题1 靶向性基因导入系统 基因治疗中的关键问题是必须将治疗基因送入特定的靶细胞，并在该细胞中得到高效的表达。2 外源基因表达的可控性 如果基因导入后表达处于无调控的状态，将会造成严重的后果。最理想的可控性是模拟人体基因本身的调控形式。这将是今后长期的追求目标。3 治疗基因过少 目前用于临床试验的治疗基因数量很少，可选择的靶基因不多。只有尽快发现并克隆大量的功能基因，迅速确定其调控序列，基因治疗才能获得更大的发展。,第十章 基因组学人类基因 组学定义及科学意义 基因组学(Genomics)于1986 年由Thomos Roderick 提出,因为它着眼于研究并解析生物体整个基因组的所有遗传信息，所以完全改变了经典遗传学“零敲碎打”的方法。指对所有基因进行基因组作图(遗传连锁图谱、物理图谱、转录本图谱),核苷酸序列分析,基因定位和功能分析的一门科学。基因组研究主要包括两方面的内容:以全基因组测序为目标的结构基因组学(Structural Genomics)和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学(Functional Genomics)。人类基因组包括24条染色体，约有30亿对核苷酸，编码了5万-6万个基因，人类基因组中携带了有关人类个体生长发育、生老病死的全部遗传信息。从整体上看，不同人类个体的基因是相同的，因此，我们说“人类只有一个基因组”。,人类基因组计划的科学意义（1）确定人类基因组中约5万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，研究基因的产物及其功能。（2）了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调解。（3）从整体水平上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小和组织，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。（4）研究空间结构对基因调节的作用。（5）发现与DNA复制、重组等有关的序列。（6）研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病的分子机制，包括遗传性疾病、易感性疾病、放射疾病甚至感染性疾病引发的分子病理学改变及其进程，为这些疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。（7）确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。了解有关病毒基因组侵染人类基因组后的影响，可能指导人类有效的利用病毒载体进行基因治疗。（8）研究染色体和个体之间的多态性。,Chairman of the Graduate School,DHUProf.David Li requests the honor of the presence of Dr.and Mrs.Jack Smith at the Christmas Evening PartySeven PM on Twenty-fifth of December,Friday on the third floor,the New Century PlazaMorning dress,national costume or Tang Suit,
