对流免疫电泳(免疫学实验).ppt

对流免疫电泳,一、基本原理在pH值8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的负电荷，而且它分子又较大，所以泳动慢，受电渗作用的影响也大，往往不能抵抗电渗作用，故在电泳时，反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分子又较小，所以泳动快，虽然由于电渗作用泳动速度减慢，但仍能向正极泳动。如将抗原置阴极，抗体置阳极，电泳时，两种成分相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇，并在比例适当的地方形成肉眼可见的沉淀线。这样由于电泳的作用，不仅帮助抗体定向移动，因而加速了反应的出现，而且也限制了琼脂扩散时，抗原抗体向四周自由扩散的倾向，因而也提高了敏感性，本法比琼脂扩散法的灵敏度要高1016倍，而且反应时间短，可用于各种蛋白的定性和半定量测定。,二、对流免疫电泳 即双扩+电泳技术用途：同双扩优点：快、敏感性高缺点：分辨力低,三、操作方法1制琼脂板 以pH8.6离子强度0.05巴比妥缓冲液配成1%1.5%琼脂凝胶板，厚度2mm3mm。2打孔 琼脂冷却后，按图打孔，打成对的小孔数列，孔径0.3cm0.6cm，孔距0.4cm1.0cm。挑去孔内琼脂，封底。3加样 一对孔中，一孔加抗原，另一孔加抗体。4电泳 将抗原孔置于负极端。电流强度3mA/cm6mA/cm，电泳时间30min90min。,四、结果观察断电后，将玻板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者则在抗原抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。如沉淀线不清晰，可把琼脂板放在湿盒中37数小时或置电泳槽过夜再观察。,五、注意事项1抗原抗体浓度的比例 当抗原抗体比例不适合时，均不能出现明显可见的沉淀线。2适当的电渗作用在对流免疫电泳中是必要的。当琼脂质量差时，电渗作用太大，而使血清中的其它蛋白成分也泳向负极，造成非特异性反应。在某些情况，琼脂糖由于缺乏电渗作用而不能用于对流免疫电泳。4当抗原抗体在同一介质中带同样电荷或迁徙相近时，则电泳时两者向着一个方向泳动。故不能用对流免疫电泳来检查。,