BDNF, TrkB 在岛叶慢性电点燃大鼠海马中的表达及与学习记忆的关系.doc

BDNF、TrkB 在岛叶慢性电点燃大鼠海马中的表达及与学习记忆的关系 徐文中 王峰 张培松 任双来 齐江华 孙涛* 收稿日期：2010-09-17 基金项目：国家自然科学基金资助（30750014）；宁夏自然科学基金资助( NZ09114) 通信作者：孙涛， E-mail：suntao（宁夏医科大学，宁夏回族自治区颅脑疾病重点实验室，银川750004）摘要： 目的 研究岛叶慢性电点燃癫痫模型大鼠的学习记忆功能，检测脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、酪氨酸蛋白激酶受体B(Tyrosine receptor kinase B，TrkB)在海马组织中表达，探讨BDNF、TRKB与岛叶点燃大鼠学习记忆的关系。方法 成年SD大鼠随机分为模型组、假手术组、空白对照组，建立大鼠岛叶慢性电点燃模型。用避暗试验方法检测岛叶慢性电点燃模型大鼠学习记忆功能，采用免疫组化和western blot方法分别检测BDNF、TrkB蛋白在海马组织中表达水平，用RT-PCR检测两因子基因表达水平。结果 岛叶慢性电刺激点燃成功后第1天（即0周），学习记忆能力点燃组与空白对照组、假手术组差异无统计学意义 (P0.05）。点燃2周点燃组避暗试验结果的LT为(48.87±3.42s)、EN为（2.75±0.99次）、点燃3周点燃组避暗试验结果的LT为(48.71±2.77s)、EN为（2.75±1.15次），与对照组（即点燃0周）相比学习记忆功能增强（P0.05），点燃4周后与对照组比学习记忆功能明显下降（P0.05）。BDNF、TrkB表达均在24h达到高峰（P0.05），空白对照组、假手术组无明显变化。组内比较，峰值及增幅均出现在23周内（P0.01)，4周后较前几周组明显下降（P0.05)。结论 岛叶电点燃大鼠学习记忆功能与BDNF、TrkB在海马中表达总变化趋势一致。BDNF、TrkB与岛叶点燃大鼠学习记忆功能密切相关。关键词：岛叶；癫痫；BDNF；TRKB；海马；避暗试验；学习记忆中图分类号： 文献标识码：A The expression of BDNF and TrkB in rat hippocampus and the relationship with learning-remembering ability in chronic electronic ignition of insular lobe.XU Wen-zhong , WANG Feng, ZHANG Pei-song ,REN Shuang-lai,QI Jiang-hua,SUN Tao. Ningxia Medical University,Key Lab of Craniocerbral Disease, NingXia Hui Autonomous Region,Yinchuan 750004,ChinaCorresponding author：SUN Tao，Email：suntao. 【Abstract】Objective To study the expression of active Skeleton Adjustment Protein(BDNF、TrkB) in rats Hippocampus in the model of insular chronic electricity-igniting epilepsy and investigate the relation between BDNF、TrkB and learning-remembering ability in the epileptic rat.Methods: To divide adult SD rats randomly into model, sham and control group, respectively. The Passive avoidance test was employed to test learning-remembering ability of rats and Immunohistochemistry and western blot was used to determine the expression of BDNF、TrkB in the hippocampus and RT-PCR was exploited to check the gene expression of the two factors.Result: There is no big difference of learning-remembering ability of rats among the igniting group or control group and sham groups ( P>0.05) in the first week after insular chronic ignition when passive avoidance test was examined. The increased learning-remembering ability appeared in the 2nd week (LT: 48.87±3.42s;EN: 2.75±0.99），3rd week(LT:48.71±2.77s;EN:2.75±1.15) after the ignition(P<0.05).It was declined in the 4th week. As for the expression of BDNF and TrkB the peak value occurred in the 24 hours (P<0.05) within the experimental groups, it kept increasing in the 2nd and 3rd week and then dropped in the 4th week, but there was no statistical difference among the control and sham groups(P>0.05). Conclusion: The general tendency of the expression of BDNF、TrkB in rat hippocampus after the chronic insular electricity ignition was consistent with the learning-remembering ability of epilepsy rats. BDNF and TrkB are closely associated with the learning-remember ability for epilepsy rats.Key words: Insula, epilepsy, BDNF、TrkB, hippocampus, learning and remembering ability, Passive avoidance test癫痫是中枢神经系统功能失常脑科临床综合征，可引起认知功能损害。2008年Bekinschtein P等研究发现脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor BDNF)及其特定受体酪氨酸蛋白激酶受体B(Tyrosine receptor kinase B，TrkB)在癫痫的学习记忆中起到重要的作用，并将持久的记忆储存海马1-3，但机制尚不明确。作为人类第五脑叶的岛叶，对记忆、学习起着至关重要的作用3-5。本研究应用避暗实验检测岛叶癫痫大鼠学习记忆功能，检测BNDF、TrkB在其海马中表达，探讨BDNF、TrkB在岛叶癫痫大鼠学习记忆的作用，初步了解岛叶起源癫痫引起认知损害的机制。1 材料与方法11 主要试剂 实验用抗体羊抗兔抗BDNF、TrkB购自SANTA CRUZ公司，蛋白实验用试剂盒均购自南京凯基生物有限公司。硝纤膜及ECL发光试剂盒购自PIECE公司。RT-RCR试验用试剂盒购自上海生物工程公司。 1.2 实验动物及分组 健康68周SD雄性大鼠180只，体重（225±15）g，由宁夏医科大学动物中心提供，随机分为：岛叶点燃组、岛叶假手术组、空白对照组。点燃组再分为：0周（从点燃当天到点燃6d)、1周、2周、3周、4周等亚组。每亚组再取1h、12h、24h时间点检测。模型点燃成功率为92.3%，模型成功率与大鼠体重未见相关性（P0.05）。每组大鼠n=6只1.3 模型制作 大鼠麻醉后，固定于SR-5R型脑立体定向仪，正中切口，以前囟为参考点；于枕、额骨区安放加固螺钉3个，螺钉兼做接地电极；参考Paxinos & Watson图谱（左侧岛叶：前囟前1.2mm，旁开5.5mm，硬膜下5.5mm），本实验电极置于左侧岛叶（电极植入左右侧差异性无相关文献报道），定向仪辅助下，垂直植入电极，恢复7d进行后续试验。后放电阈值（ADT）：单通道刺激器AM-2100型电子刺激器进行刺激，Alpha-Lab 4通道信号采集及处理系统记录大鼠脑电活动，刺激强度由 90µA开始，每次增加20µA，间隔3min，直至出现3s以上的皮层电流，此强度即为ADT。从测定ADT的第1天起，每日刺激两次，强度为ADT的1.5倍，同时观察大鼠脑电变化且记录发作强度。癫痫发作强度按Racine分级评分。连续出现5次5级发作即为点燃成功1。点燃后大鼠会出现自发癫痫发作，但在点燃后长时间（约1月）不受任何刺激下，不再出现癫痫发作，这是模型局限性。为了保持模型是癫痫鼠状态，在点燃后1周、2周、3周、4周同一时间点分别给予一次ADT的1.5倍刺激，使其5级发作一次。假手术组只植入电极，不行电刺激。1.4避暗试验 全部大鼠均采用避暗试验法进行学习记忆能力测试。大鼠在实验箱内适应2 min，实验箱分明、暗两室，两室间有一直径10cm的圆孔，暗室底部有可通电铜栅。将大鼠背对暗室的洞口放入明室，并开始计时，大鼠很快进入暗室，此时接通暗室电源，给予直流电电击大鼠，其会逃出暗室，训练5 min。24 h后，在暗室铜栅通电的情况下，将动物置于明室，记录大鼠从明室第1次进入暗室的时间为潜伏期（LT），然后记录10min大鼠进入暗室的次数即穿梭次数（EN），LT和EN共同作为记忆成绩。1.5标本收集 大鼠单笼饲养，避暗试验后用乙醚麻醉后一部分断头迅速取出海马组织，至-80冰箱以备用，另一部分用4%多聚甲醛灌注后取全脑放于蔗糖溶液梯度脱水，应用OTC（Sakura, USA）包埋，-80冰箱保存以备组织切片用。1.6免疫组化检测 采用SABC免疫组化法，兔抗鼠BDNF（1：50）、兔抗鼠TrkB(1:75),二抗（1:600），常规免疫组化操作，检测海马中BDNF、TRKB表达，应用KS400图像分析系统进行定量分析，每张切片随机取6个中倍视野，取阳性细胞百分率。1.7 RT-PCR检测mRNA表达 应用Trizol试剂常规一步法提取海马组织的总RNA，逆转录合成cDNA。 参照文献和核对得到PCR特异性引物。引物合成有上海生工合成，逆转录反应体系为模板mRNA5g，OligodNTP1.0l，加双蒸水至20l，70 5min，置冰，加入5×逆转录缓冲液5l、10mmol/LdNTPmixtrue1.25l，抑制剂0.5l，AMV逆转录酶1.0l，双蒸水2.25l，421h，70°10min。PCR反应体系（50l）：10×Buffer5.0l，10mmol/LdNTP1.0l，20mmol/L引物1.0l，Taq酶0.5l，CDNA模板1.0l，双蒸水38.5l。 BDNF的引物序列：上游:5'-CTGTATCAAAAGGCCAACTGAA-3'下游:5-GTGTCTATCCTTATGAATCGCCA-3'；941min、511min、721min，30个循环，扩增片段长度533bp。TrkB的引物序列：上游：5-CCAAGAGGCTAAATCCAGTCC-3'下游：5-CCAGGTTACCAACATCCCAATA-3；9430s、5430s、7230s，30个循环，扩增片段长度248bp。GAPDH的引物序列：上游:5-CATGGGGTGTGAACCATGAGA-3下游:5-GTCTTGGGGTGGCAGTGTAT-3 扩增片段长度251bp。以PCR扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶成像分析仪进行半定量分析。1.8 Western 印迹检测蛋白表达 将冰冻的海马组织用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。依次加入5×上样缓冲液煮沸（100，5min）、上样（30l/空）、电泳、转膜、封闭，滴加一抗（比例BDNF;1:600,TrkB；1:750)4摇晃12h，PBST洗膜15min×3次，滴加生物素标记的二抗（比例均为1:1500),4摇床3h，PBST洗膜10min×3次后行ECL发光5min，应用胶片曝光,扫入凝胶成像系统进行灰度分析。1.9 统计分析 采用SPSS11.5统计软件包进行分析。所得数据以±s表示，各组数据采用多因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。 2 结果 2.1避暗试验 各组各个时间段大鼠空白对照组与假手术组比较，无统计学意义。点燃组大鼠在点燃当天（0周）潜伏期、穿梭次数与空白、假手术对照组无统计学意义，点燃2周 、3周与点然当天相比潜伏期缩短，穿梭次数减少（P0.05），点燃4周与前几周比较，潜伏期均缩短，穿梭次数增加（F=23.521,P0.01）。见表1。 表1大鼠避暗试验结果 （n=6）分组 0周 1周 2周 3周 4周空白组假手术组点燃组LT/s EN/次LT/sEN/次LT/sEN/次55.00±2.833.33±1.0254.67±2.733.33±1.0356.25±2.013.42±0.9355.33±2.163.32±1.0354.33±2.163.32±1.0254.83±2.823.33±1.0455.01±2.613.33±1.0453.16±1.953.63±0.8748.87±3.42*2.75±0.99*54.83±2.863.33±1.0554.83±2.223.33±1.0548.71±2.77*2.75±1.15*53.83±3.063.31±1.0355.16±2.863.46±0.8937.54±1.59*6.75±1.29* 与同组0周比较* P0.05，*P0.01；组间比较P0.05，P0.01。2.2 免疫组织化学结果 BDNF免疫组织化学染色阳性结果表现为海马细胞胞质成棕黄色，TrkB为胞膜呈棕黄色。BDNF、TRKB在试验各组为1h表达开始增加，24h达到高峰。其峰值高峰段维持在23周时间段内，4周峰值明显降低。空白对照组与假手术组无明显变化。图1。图21：1h 时BDNF；2：1h 时TrkB；3：24h时BDNF；4：24h时TrkB，“”示细胞阳性表达图2点燃1周组1h、24h时间点海马细胞BDNF、TrkB的表达 ×4002.3 RT-PCR结果 maker的对照下目的条带清晰可见，测定各条带的光密度值，BDNF、TrkBmRNA在试验各组均表示出1h开始增加，24h达到峰值，同样其峰值高峰维持在点燃后23周，空白组与假手术组无明显变化。图3BDNF及TrkBmRNA光密度值： a、b、c、d、e:GADPH；m：maker，A：0周组24h；B：1周组24h；C：2周组24h;D：点燃3周组24h;E:点燃4周组24h图4 BDNFmRNA、TrkBmRNA在海马中各周不同24h的表达2.3 western印迹结果 各个试验组大鼠海马中BDNF、TRKB均有表达，BDNF、TrkB蛋白在各点燃组均为24h时表达高于1h与12h时间点(P0.01)，各组峰值蛋白相对量空白对照组比较，23周峰值最高（P0.05），4周峰值明显下降（P0.01）。空白对照组与假手术组无明显变化。图5、6。 图5 BDNF、TrkB在各组不同时间点蛋白表达相对量 A:1h；B：12h；C：24h；D：空白组；E：假手术组；1：空白组；2：假手术组；3：1h;4:12h；5:24h图6 点燃3周刺激后BDNF、TrkB蛋白表达3 讨论BDNF是神经元产生的神经营养因子，在脑内含量丰富，在CNS的发育过程中，参与神经的可塑性，并参与调节学习和记忆过程。TrkB是由酪氨酸激酶原癌基因编码的一种神经营养素家族（Neurotrophins，NTFs）高亲和力受体，BDNF必须与其受体TrkB结合，才能发挥其生物学功能。由于海马是研究脑的学习和记忆功能的一个重点部位，癫痫患者以及各类癫痫动物模型中，均会出现海马硬化的形态学改变，所以取海马作为分子生物学检测部位。避暗试验可实现组间平行操作，对记忆过程特别是对记忆再现有较高的敏感性。本实验研究发现点燃初期，大鼠的学习记忆功能与对照组无差异，点燃23周时，表现为潜伏期缩短，穿梭次数减少；而4周后差异更为明显，潜伏期缩短，但穿梭次数却明显增多，说明大鼠对训练后学习内容记忆功能减弱或缺失，所以认为岛叶癫痫大鼠初期学习记忆功能无明显改变，23周间学习记忆增强，达到4周以后学习记忆功能下降。 BDNF是一个重要的突触可塑性形成学习记忆的中介1，而BDNF是由第一个作为糖化前躯体的（proBDNF，然后转换到细胞之内的而成为成熟BDNF，储存和释放刺激细胞形成学习记忆功能2，而BDNF依赖性信号传导途径通过活化TrkB受体，通过水解磷脂酶C（PLC)、磷脂酰环己六醇激酶-3（PI3K）、细胞外信号调节激酶（ERK）、促细胞分裂活性蛋白激酶（MAPK）等的信号通路激活，通过细胞内Ca2+发挥作用，且也调节BDNF、TrkBmRNA的转化和蛋白向树突的运输，这些机制是负责翻译能力和调节突触传递和突触形成，从而增强和维持学习记忆功能3。TrkB属于受体型酪氨酸蛋白激酶，是BDNF的特异性受体。BDNF与靶细胞膜上TrkB受体结合，促进TrkB同源二聚体的形成，激活受体酪氨酸激酶活性，导致该受体发生细胞内区域的酪氨酸残基的自身磷酸化，继而激活下游一系列的酪氨酸磷酸化过程4-10。酪氨酸磷酸化的TrkB作为BDNF信号转导途径的中介将信号进一步传递给下游的衔接蛋白及其相关活性酶,从而参与促进学习记忆功能机制。通过RT-PCR、western blot及免疫组化等技术研究发现岛叶癫痫早期，BDNF、TrkBmRNA及蛋白的表达明显增加，其机制可能是神经系统受自发性放电刺激后影响BDNF、TrkBmRNA的转录及翻译水平，使相应蛋白的表达增加（即24h点明显高于1h、12h点，但随着癫痫的持续发作，表现为各周组24h峰值不同，23周峰值最高），两因子相互作用，表现在突触可塑性、稳态可塑性，使其在记忆巩固中起到核心作用，表现为苔藓纤维出芽(Mossy fiber sprouting, MFS)、突触重构等突触可塑性改变，从而提高了大鼠学习记忆功能；表现在行为学实验，穿梭次数减少，潜伏期延长，以及在暗箱内活动路程明显缩短。但随着蛋白在执行功能过程中逐渐降解及在长时间（约4周）的癫痫放电刺激下BDNF、TrkB的关键酶（如钙钙调素依赖的蛋白激酶II（CaMKII等）活性的降低和Ca2+电压门控通道功能的降低，使BDNF、TrkB逐渐减少，致使学习记忆功能减退。行为学实验表现为穿梭次数增加、潜伏期缩短，暗箱活动时间长等。分子生物学实验与行为学实验相平行。综上所述BDNF、TrkB对癫痫的学习记忆等认知功能起到重要的作用，但机制尚未完全阐明，有待进一步研究。参考文献：1 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