《蛋白质化学》总复习.ppt

蛋白质化学总复习,课程内容,第二章 蛋白质的合成、转运、加工与修饰第三章 蛋白质的结构与功能第四章 蛋白质的分离纯化第五章 蛋白质定性定量检测第六章 蛋白质的生物信息学第七章 蛋白质组学理论与进展第八章 蛋白质芯片理论与进展,第二章 蛋白质的合成、转运、加工与修饰,基本概念SD序列/核糖体结合位点（RBS）信号肽分子伴侣,回答问题：1蛋白质在生物体内合成时所涉及的几个重要元素是什么？它们的结构特征及其在蛋白质生物合成中的作用如何？2原核生物中蛋白质合成过程分哪几个阶段？对每个阶段的过程描述；每个阶段所涉及的辅助因子及其功能？3.原核细胞与真核细胞的核糖体理化性质比较4蛋白质在细胞内跨膜位移过程中所涉及的重要元素有哪些？它们的结构特征及其在蛋白跨膜机制中的作用如何？（简述分泌性蛋白质跨膜移位的信号假说）5蛋白质合成后一级结构上和高级结构上的修饰有哪些？理解分子伴侣的概念及其在蛋白折叠中的作用。（蛋白质合成后的加工与修饰）,第二章 主要内容,1蛋白质在生物体内合成时所涉及的几个重要元素2原核生物中蛋白质合成过程3蛋白质在细胞内跨膜位移过程4.蛋白质合成后的修饰,1蛋白质在生物体内合成时所涉及的几个重要元素,（1）信使RNA（messenger RNA,mRNA）（2）遗传密码（3）核糖体（4）转运RNA（transfer RNA,tRNA）,（1）信使RNA（messenger RNA,mRNA）,SD序列/核糖体结合位点（RBS）：原核细胞mRNA的翻译起始密码子AUG的上游相距813个核苷酸处有一段由68个核苷酸组成的富含嘌呤的序列，以5-AGGAGG-3为核心，它与核糖体小亚基上的16S-rRNA 的近3末端处的一段短序列互补。,（2）遗传密码,三联体密码（triplet code）/密码子（codon）：mRNA采用每三个相邻碱基编码一个氨基酸。61个密码分别代表各种氨基酸（amino acid，aa）。一种aa少的只有1个密码（色氨酸和蛋氨酸），多的可有6个，但以2个和4个居多。终止密码子：UAA、UGA和UAG。起始密码子/蛋氨酸密码子：AUG（91）/GUG（8）。遗传密码的特点：遗传密码的连续性、通用性、简并性、摆动性、不重叠性,（3）核糖体,核糖体上的4个活性部位：受位/A位：氨酰基位点。即接受氨酰-tRNA的部位。供位/P位：肽酰基位点。肽基-tRNA移交肽链后，tRNA被释放的部位。肽基转移酶/转肽酶位：肽链合成过程中催化形成肽键的酶活性部位。GTP酶位：可水解GTP，为催化肽基-tRNA由A位转到P位提供能量的酶活性部位。核糖体的存在形式：核糖体单体无蛋白合成功能多聚核糖体：与mRNA结合具有蛋白合成功能游离核糖体结合核糖体（与内质网膜结合）原核细胞与真核细胞的核糖体理化性质比较（见课件）,（4）转运RNA（transfer RNA,tRNA）,特点：分子量较小，沉降系数约为4S，约占细胞中RNA总含量的1015，在蛋白质合成时起搬运氨基酸的作用。它对不同的氨基酸有特异性，一种tRNA只能搬运一种氨基酸。与蛋白质合成有关的位点氨基酸（aa）结合位点反密码子位点识别aa-tRNA合成酶的位点。翻译过程中行使“起动”作用的tRNA：能特异地识别起始密码子AUG蛋氨酰-tRNA（真核细胞）；甲酰蛋氨酰-tRNA（原核细胞或线粒体）氨酰-tRNA合成酶的专一性：对aa有极高的专一性，每种aa都有一个专一的酶。只作用于L-氨基酸，不作用于D-氨基酸。有的酶对aa的专一性并不很高，但对tRNA却有极高的专一性。,2原核生物中蛋白质合成过程,（1）起始过程（2）肽链延伸（3）肽链合成的终止与释放（4）原核生物中蛋白质合成过程所涉及的蛋白因子,（1）起始过程,大小亚基分开（在IF-3作用下）；mRNA与小亚基结合形成30S起始复合物：在IF-2作用下，fMet-tRNAt与mRNA分子中的AUG相结合（在P位上），即密码子与反密码子配对，形成30S起始复合物）大小亚基结合，形成有生物学功能的70S起始复合物。此时核糖体的位被fMet-tRNA和占据；而A位则空着，有待于对应mRNA中第二个密码的相应氨基酰tRNA进入，从而进入延伸阶段。,（2）肽链延伸,进位：Tu-GTP与aa2-tRNA2结合成复合物；aa2-tRNA2与A位点上mRNA密码子结合；重新生成Tu-GTP。肽键形成：在转肽酶作用下，形成肽键，成2肽；P位点上fMet与tRNA脱离；此时，P位空出。移位：在移位酶(G)作用下，消耗1个GTP,核糖体沿mRNA 53移动了1个密码子的距离.；A位上的肽酰-tRNA到P位，原来P位上无负载的tRNA离开核糖体。(此时核糖体的A位空着，有待于接受下一个aan-tRNAn)重复至肽链必需长度。,（3）肽链合成的终止与释放,RF与mRNA终止信号结合，激活转肽酶；水解肽链和 tRNA间的键，新合成肽链、tRNA、mRNA离开核糖体，后者即解离成大、小亚基，进入下一轮反应。,（4）原核生物中蛋白质合成过程所涉及的蛋白因子,起始因子（IF1、IF2、IF3）IF1：无专门功能，协助IF2和IF3的作用。IF2：IF2先与GTP结合，再结合fmet-tRNA，形成fmet-tRNA-IF2-GTP复合物，同时推动mRNA在30S亚基上移动，使fmet-tRNA到达P位。IF3：翻译起始时结合于核糖体30S亚基靠近50S亚基的边界，使大小亚基拆离。延长因子（EF）EF-Tu：按mRNA编码序列携带氨酰-tRNA进入A位。EF-Ts：使EF-Tu和GTP再生，参与肽链延长。EFG：具有转位酶活性。使肽酰-tRNA从A位转移到P位。释放因子（RF，RR）RF：辨认终止密码子和促进肽链C端与tRNA 3-OH酯键的水解，使肽链从翻译中的核糖体上释放下来。RF1：辨认UAA和UAG，进入A位。RF2：辨认UAA和UGA，进入A位。RF3：激活核糖体上的转肽酶。转肽酶受RF3作用后发生变构，表现出酯酶的水解活性，水解肽酰-tRNA之间的酯键，使P位上的肽与tRNA分离。RR：使tRNA、mRNA及RF均从核糖体脱落。,3蛋白质在细胞内跨膜位移过程,（1）信号假说中涉及的几个重要元素信号肽 信号识别颗粒（SRP）SRP受体（SRP-R）移位子（易位子）（2）蛋白质跨膜位移的机制信号肽与SRP结合肽链延伸暂时终止SRP与受体结合SRP脱离信号肽肽链在内质网上继续合成，同时信号肽引导新生肽链进入内质网腔信号肽切除肽链延伸至终止。,4.蛋白质合成后的加工与修饰,（1）一级结构的加工与修饰-共价修饰蛋白质前体的剪切。包括信号肽、前导肽或插入肽的剪切。氨基酸侧链的共价修饰。糖基化、羧基化、磷酸化、乙酰化、甲基化、二硫键的形成（多肽链内或链间）和脂基化等。去除N-甲酰基或N-蛋氨酸。水解修饰。指一条多肽链经翻译后加工产生多种不同活性的蛋白质或肽。（2）高级结构的加工与修饰蛋白质亚基的聚合具有四级结构的蛋白质由两条以上的肽链通过非共价键聚合，形成寡聚体蛋白质。辅基链接形成结合蛋白质。分子伴侣（molecular chaperones）：一类参与蛋白质的转运、折叠、聚合和解聚、错误折叠后的重新折叠、水解以及原始蛋白质活性的调控等一系列功能的保守蛋白质家族。,第三章 蛋白质的结构和功能,基本概念氨基酸（aa）的结构物质的构型和构象肽键与异肽键肽单元/肽键平面蛋白质的一级结构蛋白质的二级结构蛋白质的超二级结构蛋白质的结构域蛋白质的三级结构蛋白质的四级结构结构生物学蛋白质工程,回答问题：1蛋白质的各种结构层次的基本概念和特点？2.肽键和异肽键的区别？肽键的结构特征。3.二级结构的分类及其形成的内在原因？-螺旋的结构特点?-折叠/-片层的结构特点?-转角的结构特点?4.蛋白质的超二级结构及其组合方式；超二级结构和结构域的区别与联系。5.维系蛋白三级结构的主要作用力有哪些？什么情况下蛋白质存在四级结构？6蛋白质的生物学功能有哪些？7结构生物学的基本概念？蛋白质工程的基本概念？蛋白质工程与基因工程的区别与联系？,第三章 主要内容,1蛋白质的各种结构层次2蛋白质的生物学功能3结构生物学,1蛋白质的各种结构层次,蛋白质的基本结构单位 氨基酸和肽键 蛋白质的一级结构 蛋白质的二级结构 蛋白质的超二级结构：在多肽链内顺序上相互邻近的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成规则的二级结构组合体。它们可直接作为三级结构的“建筑块”或结构域的组成单位，是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次，故称超二级结构。目前发现的超二级结构有三种组合方式：-螺旋组合()；-折叠组合()和-螺旋-折叠组合()，其中以组合最为常见。蛋白质的结构域：是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次。在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，形成二个或多个在空间上可以明显区别它与蛋白质亚基结构的区域。一般每个结构域约由100200个氨基酸残基组成，各有独特的空间构象，并承担不同的生物学功能。蛋白质的三级结构 蛋白质的四级结构,2蛋白质的生物学功能,酶的催化机械支持运输和储存协调动作免疫保护生长和分化的控制神经冲动的传递细胞内信号转导跨膜运输电子传递,3结构生物学,结构生物学：以分子生物物理学为基础，结合化学和分子生物学方法测定生物大分子复合体的空间结构、精细结构以及结构的运动，阐明其相互作用的规律和发挥生物功能的机制，从而揭示生命现象本质的科学。蛋白质的结构生物学的研究方法借助现代分析手段（X线晶体学、核磁共振及电子晶体学等）直接得到蛋白质三维构象的信息；借助数学模型、计算机软件等工具，根据蛋白质的一级结构来预测其空间结构。利用蛋白质工程的技术手段，得到非天然存在的蛋白质。蛋白质工程是指通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和蛋白质动力学等研究获取关于蛋白质结构和物化性质等方面的信息，在此基础上对编码该蛋白的基因进行有目的的设计改造，并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终将其投入实际应用。它以现有蛋白质的结构与功能为基础，以制造具有新性能的新型蛋白质为最终目的。,第四章 蛋白质的分离纯化,基本概念蛋白质的等电点蛋白质的变性、蛋白质的复性蛋白质的沉淀、盐析法蛋白质的结絮作用、蛋白质的凝固蛋白质的紫外吸收、蛋白质的呈色反应差速离心、密度梯度离心聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-PAGE梯度胶电泳等电聚焦电泳（IEF）IEF/SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2-DE）毛细管电泳,回答问题：1蛋白质有哪些理化性质？等电点、酸性蛋白、碱性蛋白的概念？可逆沉淀和不可逆沉淀、可逆变性和不可逆变性的概念？2蛋白质分离纯化的常用方法有哪些？理解每种方法的基本原理和分类分离纯化蛋白质样品的常用沉淀法有哪几种？膜分离法的分类。3电泳技术的基本原理和分类？常用的几种电泳技术聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳及毛细管电泳的基本原理和特点。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中制备凝胶所涉及的组分及其作用；蛋白质被PAGE电泳所分离主要基于的效应；SDS-PAGE的原理/SDS在SDS-PAGE中的主要作用。4.IEF/SDS-PAGE与其单相电泳具体操作的差别；电泳后蛋白质的回收方法。,第四章 主要内容,1.蛋白质的理化性质2.蛋白质分离纯化的常用方法3.电泳技术,1蛋白质的理化性质,（1）蛋白质的两性电离特性（2）蛋白质的胶体性质（3）蛋白质的沉淀特性（4）蛋白质的变性（5）蛋白质的紫外吸收特性（6）蛋白质的显色反应,（1）蛋白质的两性电离特性,蛋白质的等电点：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。酸性蛋白（pI7）当蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质带负电荷，反之则带正电荷。,（2）蛋白质的胶体性质,由于蛋白质属高分子物质（分子量范围101000 kDa），它在水中的颗粒大小约1100nm，能够形成胶体溶液。蛋白质形成亲水胶体溶液的稳定因素：分子表面的水化层和电荷层。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如扩散慢、黏度大、不能透过半透膜等应用：由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,（3）蛋白质的沉淀特性,蛋白质的沉淀：蛋白质分子凝聚而从溶液中析出的现象。可逆沉淀：在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀（或可逆沉淀）。不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。,（4）蛋白质的变性,蛋白质的变性：在某些物理或化学因素作用下，蛋白质的空间构象破坏（不包括肽链的断裂等一级结构变化），导致蛋白质若干理化性质和生物学活性的改变。可逆变性：蛋白质在变性后，除去变性因素仍可恢复其活性，称为可逆变性（可逆变性也是蛋白纯化中常用的一种手段）。不可逆变性：蛋白质变性时其空间结构严重破坏，除去变性因素后不能恢复其生物学活性，称为不可逆变性。蛋白质变性的因素：物理因素：高温、高压、紫外线、X射线照射、超声波、剧烈震荡和剧烈搅拌等。化学因素：强酸、强碱、重金属盐、有机溶剂、尿素和十二烷基磺酸钠（SDS）等。生物学活性的丧失并不一定完全是变性的结果，如蛋白质肽链水解断裂、去除辅基和应用抑制剂等，均可导致蛋白质失活。蛋白质的复性：若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原来的构象及功能。蛋白质变性的发展结絮作用：通过强酸/强碱变性后的蛋白，当溶液的pH调到其等电点时，蛋白质会形成絮状的不溶物，称为蛋白质的结絮作用。凝固作用：结絮后的蛋白进行加热后会变为比较坚固的凝块，称为蛋白质的凝固作用。如：煮熟的鸡蛋、豆腐的形成等。,（5）蛋白质的紫外吸收特性,蛋白质分子中有含有共轭双健的酪氨酸、色氨酸等残基在280nm波长下具有最大光吸收。因此280nm的光吸收度是蛋白质的一种普遍性质。在一定波长范围内，蛋白质溶液在280nm吸光度与其浓度成正比，故可作定量测定。,（6）蛋白质的显色反应,茚三酮反应：还原型的茚三酮可与氨基酸加热分解产生的氨结合，再于另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色的化合物。此化合物的最大吸收峰在570 nm波长处。由于此吸收峰值的大小与氨基酸释放出的氨量成正比，因此可作为氨基酸定量分析方法。双缩脲反应：蛋白质和多肽分子在碱性溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，称为双缩脲反应。,2蛋白质分离纯化的常用方法,（1）离心法（2）沉淀法（3）膜分离法,（1）离心法,沉降速度法/差速离心：如果两种蛋白质的沉降系数相差一个数量级以上，可用差速离心，反复多次达到分离效果。开始在一个较低的速度下离心，使沉降系数大的物质沉淀，其他物质仍保留在溶液中。取上清，在更大的离心场中再离心，又会获得一些沉淀物质，如此反复多次，便可使混合物逐级被分开。密度梯度离心：如果两种蛋白质的沉降系数相差不到一个数量级，用差速离心很难奏效，若改用密度梯度离心，便可获得比较满意的分离效果。在离心管中造成一个梯度密度环境，使介质的最大密度大于分离物的最大密度。而后加入待分离物，在离心力的作用下，当分离物的密度与介质密度相等时，分离物即停留在与其密度相同的区域，从而达到分离目的。离心时离心管中的介质是不均一的，从近中心到远中心密度不断增加，形成梯度。常用的梯度介质有甘油、蔗糖、溴化钾、氯化铯。,（2）沉淀法,等电点沉淀法：蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。有机溶剂沉淀蛋白质：可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇和丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。盐析法：在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。有机聚合物沉淀法：有机聚合物沉淀剂与水分子通过氢键结合，使溶质溶解度降低，从而得到沉淀。沉淀剂为非离子聚合物，如：PEG聚乙二醇（PEG2000、PEG4000和PEG6000）、PVP及葡聚糖等。,（3）膜分离法,定义 分类根据推动力不同，可分为：透析法（Dialysis，DS）（以膜两侧的浓度差为推动力）膜过滤法（以膜两侧的压力差为推动力）根据膜孔径大小不同，膜过滤法可分为：微过滤（Microfiltration，MF）超滤（Ultrafiltration，UF）反渗透法（Reverse osmosis，RO）纳滤法(Nanofiltration，NF),3电泳技术,（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳（2）等电聚焦电泳（3）双向凝胶电泳（4）毛细管电泳,（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶的形成原理：是由单体丙烯酰胺（Acrylamide，Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bisacrylamide，Bis），在加速剂四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂过硫酸铵（AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。蛋白质被PAGE电泳所分离，主要基于电荷效应和分子筛效应。如果缓冲液系统为不连续系统，还要加上浓缩效应（凝胶浓度的不连续性、离子成分及pH的不连续性、电位梯度的不连续性）。当所分离的蛋白成分复杂、分子质量范围较大时，使用浓度梯度PAGE进行分离效果更好。浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳是指随着凝胶浓度逐渐增高，凝胶孔径逐渐减小，不同大小蛋白质分子的移动就会在不同的区域受阻，形成较窄的区带。SDS-PAGE的原理 SDS在SDS-PAGE中的作用是什么？,（2）等电聚焦电泳,等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理：等电聚焦就是在电解槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度。蛋白质在此体系中因解离而带不同的电荷，其泳动率也不同。各蛋白质分子泳动到各自的等电点时即停止移动，形成很窄的一个区带，彼此得以分离。,（3）双向凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2-DE）的第一向是等电聚焦电泳，第二向是SDS-PAGE。IEF/SDS-PAGE的第一相常用柱状电泳，第二相常用板状电泳。虽然IEF/SDS-PAGE的原理与IEF-PAGE、SDS-PAGE单相电泳的原理基本相同，但在具体操作上却有较大的差别。第一相的电泳分离系统与IEF-PAGE不同第二相的加样操作与SDS-PAGE不同,第一相的电泳分离系统与IEF-PAGE不同,第一向相电泳系统中的样品处理液中加入高浓度的尿素和适量的非离子型去垢剂NP-40，还需加入二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）。这些试剂可破坏蛋白质分子内的二硫键，使蛋白质变性，有利于第二相中蛋白质与SDS充分结合；这些试剂本身并不带电荷，不会影响蛋白质原有的电荷量和等电点。第一向电泳的环境温度保持在2035。尿素在低温时容易析出，在高温时容易分解。,第二相的加样操作与SDS-PAGE不同,第一向电泳结束后，凝胶柱用去离子水洗3次，再放入第二向SDS-PAGE的浓缩胶缓冲液含-巯基乙醇（-ME）和SDS中震荡平衡。使凝胶柱内原有的第一相电泳分离系统被第二相的电泳分离系统所取代。-ME使蛋白质分子中的二硫键保持还原状态，以便蛋白质与SDS充分结合，从而完成第二向的样品处理。经平衡处理后的凝胶柱包埋在第二相的凝胶板上端，完成第二相电泳的加样。,（4）毛细管电泳,毛细管电泳（CE）是在内径为25100 m的石英毛细管中进行电泳。它的分离原理是被分离物质差速运动的结果。在毛细管电泳中，物质主要有两种运动：电泳和电渗。（理解电渗现象的基本概念）物质粒子在毛细管中的运动速度是这两种运动速度之和。通常电渗流的速度是电泳流速度的57倍，因而粒子的速度主要由电渗速度决定，因而可以实现所有的样品组分向同一方向泳动及正负离子的同时分离。正离子的泳动方向与电渗方向相同，最先流出；中性离子的泳动速度为零，在正离子后流出；负离子的泳动方向与电渗方向相反，最后流出。,第五章 蛋白质的定性定量检测,基本概念免疫组织化学ABC法酶联免疫吸附实验（ELISA）Western blotting/免疫印迹,回答问题：1免疫组织化学基本概念和操作过程、显色反应ABC法的基本原理及其操作过程。2免疫组织化学的具体应用酶联免疫吸附实验（ELISA）的基本原理和几种不同的实验方法；叙述使用双抗体夹心法/三明治法检测某种蛋白质的简要步骤。3免疫印迹法的基本原理和实验过程；叙述使用Western blot/免疫印迹法检测某种蛋白质的简要步骤4叙述各种蛋白质的定量检测方法的实验原理。,第五章 主要内容,1.免疫组织化学2.酶联免疫吸附实验（ELISA）3.免疫印迹法（Western blotting）4.各种蛋白质的定量检测方法,1.免疫组织化学,免疫组织化学：免疫学与组织化学相结合的一个分支学科。以免疫学的抗原-抗体反应为基础的理论，其可作为蛋白质定位、定性及半定量检测的方法之一。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜和电子显微镜等）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等），也可在原位显示相应的基因和基因表达产物。免疫组织化学的简要步骤包括：（1）抗体的制备。1）抗原的提取和纯化。2）免疫动物制备多克隆抗体或细胞融合制备单克隆抗体。3）抗体效价检测和纯化。4）标记复合物的制备。（2）抗原的检测。1）细胞或组织切片的制备。2）免疫组织化学反应和显色。（3）结果观察和记录。ABC法（avidin-biotin-enzyme complex，ABC）：美籍华人Hsu于1981年首次报道。它是以卵白素作为桥，把生物素化的抗体（二抗）与生物素结合酶（如生物素标记的HRP）连接起来，形成avidinbiotinenzyme complex，即ABC。,ABC法的操作过程,2.酶联免疫吸附实验（ELISA）,基本原理：先将已知抗体或抗原结合在某种固体载体上，并保持其免疫活性；利用标记技术，将酶标记到抗体（或抗原）上。测定时，将待测样本和酶标抗体或抗原按不同步骤与固体载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，形成抗体-抗原复合物；加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度值的大小进行定性或定量分析。实验方法（分类）间接法（用于测定抗体的常用方法）双抗体夹心法（用于测定抗原的常用方法）/桥连ABC-ELISA夹心法竞争法（用于测定抗原、半抗原及抗体）,使用双抗体夹心法/三明治法检测某种蛋白质,向微孔板内加入单克隆抗体进行包被，4C反应24-36 h。用PBST洗涤3次。加入封闭液，37C封闭反应2 h或4C反应过夜。向微孔板内加入待侧样品，37C反应45-60 min。用PBST洗涤3次。向微孔板内加入酶标抗体，37C反应45-60 min。用PBST洗涤5次。显色反应。室温避光反应15 min。酶标议检测。结果分析。,3免疫印迹法,Western blotting/免疫印迹：蛋白样品经过SDS-PAGE分离后，转移到膜上，然后应用抗原抗体反应进行特异性检测的方法。它是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白的定性方法，也可以作为确定同一种蛋白在不同细胞或同一种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法。应用：使用Western blotting/免疫印迹法检测某种蛋白质。,使用免疫印迹法检测某种蛋白质,用纯化的蛋白免疫小鼠，得到某种蛋白特异性的抗血清。制备样品，用SDS-PAGE电泳分离。用半干式电转移法将蛋白转至PVDF膜或NC膜上。将膜在封闭液中室温反应45-60 min。转移膜至用封闭液稀释的蛋白特异性的抗血清（一抗工作液）中，室温反应45-60 min。TBST漂洗3 10 min。转移膜至用封闭液稀释的碱性磷酸酶（AP）偶联的羊抗鼠IgG（二抗工作液）中，室温反应45-60 min。TBST漂洗3 10 min。显色反应。将膜浸泡在NBT/BCIP显色液中，避光静置，待出现清晰条带后，把膜转移至蒸馏水中中止反应。,4各种蛋白质的定量检测方法,凯氏定氮法。双缩脲法。Folin-酚试剂法（Lowry法）。紫外-分光光度法。考马斯亮蓝G-250染色法。BCA法。,第六章 蛋白质的生物信息学理论,基本概念序列对比序列的相似性（similarity）序列的同源性（homology）直系同源旁系同源局部和整体相似性序列对比,回答问题：1蛋白质的生物信息学的概念及内容。2国际上最著名的三大DNA数据库是什么？3.世界上第一个专门从事蛋白质序列、结构、功能和蛋白质2D-PAGE图谱等的分析网站是什么？4序列对比和数据库搜索的基本概念：同源性和相似性的区别，数据库搜索和数据库查询的区别。5.简述序列对比的理论基础。4较广泛的序列相似性搜索工具有那些？,第六章 主要内容,1蛋白质的生物信息学的概念及内容2常用的几个DNA数据库3序列对比和数据库搜索4生物信息学研究的主要工具,1蛋白质的生物信息学的概念及内容,生物信息学的基本概念广义上讲，生物信息学是对生物信息的获取、加工、储存、发布、分析和解释，并综合运用数学、计算机科学和生物学等工具，以达到理解数据中的生物学含义的目标。是生物与信息技术的结合。狭义上讲，生物信息学是把基因组DNA序列分析作为源头，找到基因组序列中代表蛋白质和RNA基因的编码区，阐明非编码区的信息实质，破译隐藏在DNA序列中的遗传规律；同时，在此基础上，归纳、整理与基因组遗传信息释放及其调控相关的转录谱和蛋白质谱的数据，从而揭示生命体的生长、发育、代谢和进化的规律。生物信息学的研究内容建立可以存放和管理大量生物信息学数据集开发确定大数据集中各成员关系的算法和统计方法，并设计一些相应的工具软件。使用这些工具来分析和解释不同类型的生物数据，包括DNA、RNA和蛋白质序列、蛋白质结构、基因表达及生化途径。,蛋白质生物信息学的主要内容,基因功能表达谱的研究，探讨基因在特定时空中的表达。确定核酸序列中编码蛋白质的基因，了解蛋白质的功能及其分子基础，运用蛋白质结构模拟与分子设计进行功能预测对已知的各种代谢途径和相关的生物分子的结构和功能及它们之间的相互作用进行整理，用以研究细胞发育、分化途径和疾病的发生与发展的途径，并将这些信息与生命体和生命过程的生理生化信息相结合，阐明其分子机制，最终进行蛋白质及核酸的分子设计、药物设计和个体化的医疗保健设计等。其他。例如，序列对比，结构对比；计算机辅助基因识别，非编码区分析；分子进化和比较基因组学；基因芯片设计；序列重叠群装配；生物信息处理并行算法的研究；蛋白质组学数据分析等等。,2常用的几个DNA数据库,美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank数据库，欧洲生物信息学研究所（EBI）维护的EMBL核酸序列数据库日本国立遗传学研究所（NIG）建立的日本DNA数据库（DDBJ），并列为国际上最著名的三大DNA数据库。,3序列对比和数据库搜索,在生物信息学研究中，序列对比是最常用和最经典的一个研究手段。将研究对象进行相互比较来寻找研究对象可能具备的某些特性。从核酸及蛋白质的一级结构方面来分析序列的相同点和不同点，从而能够推测它们的结构、功能及进化上的联系。序列对比的理论基础是进化学说。如果基因和蛋白质序列之间具有足够的相似性，就推测两者可能有共同的进化祖先，经过序列内残基的替换、缺失以及序列重组等遗传变异过程分别演化而来。序列的相似性（similarity）：在序列对比中描述两条序列之间相同碱基或氨基酸残基所占比例（可进行量化）。序列的同源性（homology）：指从大量数据中推断出的两个基因在进化上具有共同祖先的结论（不可进行量化）。在生物信息学研究中，局部相似性序列对比更合理，应用也比较广泛。其生物学基础是蛋白质功能结构域的高度保守性。所以，通过比较分析保守位点上的残基可以对蛋白质的结构和功能进行预测。,4生物信息学研究的主要工具,蛋白质分析专家系统（Expert Protein Analysis System，ExPASy）是于1994年由瑞士生物信息学院（Swiss Institute of Bioinformatics，SIB）创立的世界上第一个分子生物学网站，专门从事蛋白质序列、结构、功能和蛋白质2D-PAGE图谱等的分析。较广泛的序列相似性搜索工具：FASTA、BLAST和BLITZ等。,第七章 蛋白质组学理论与进展,基本概念基因组（genome）DNA微阵列蛋白质组蛋白质组学表达蛋白质组学细胞图谱蛋白质组学串联质谱肽质量指纹谱,回答问题：,1.蛋白质组学的基本概念及意义。2.蛋白质组和基因组的主要区别。3.蛋白质组学研究的几个重要的技术平台。4.二维电泳的基本原理和实验过程。5.质谱技术的基本原理和质谱仪的组成部分。6.两种常用的软电离技术的基本原理和特点，为什么它们可以用于生命科学领域的研究？7.几种常用的质量分析器的基本原理和特点。8.质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程。9.质谱技术在蛋白质及多肽分析中的应用。10.酵母双杂交的基本原理、缺陷及其发展。11.蛋白质组学在医药学中的应用。,第七章 主要内容,1.蛋白质组学的基本概念及意义2蛋白质组学研究的几种重要的技术平台3.蛋白质组学在医药学中的应用,1.蛋白质组学的基本概念及意义,基因组（genome）：生物体内一套完整单倍体的遗传物质的总和。由基因和基因外的核苷酸序列组成。包括基因组DNA（某些病毒为RNA）、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA。DNA微阵列（DNA Microarray）又称为基因芯片（Gene Chip）或DNA芯片（DNA Chip），是在核酸水平进行目的基因表达规律研究的方法。它采用原位合成或直接点样的方法将DNA片段或寡核苷酸片段排列在硅片或玻璃等介质上形成微阵列，待检样品（cDNA）用荧光分子或同位素标记后与微阵列杂交，通过信号扫描及计算机分析即可获得样品中大量的基因序列及表达信息，以达到快速、高效和高通量地分析基因表达规律的目的。蛋白质组：指由一个基因组、细胞或组织表达的所有蛋白质。蛋白质组和基因组的主要区别：蛋白质组是动态的；基因组是相对恒定的。蛋白质组学（proteomics）：从整体上研究细胞或组织内，特定的时间和空间内全部蛋白质的组成及其相互作用规律的学科。通过蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内定位以及相互作用等研究，阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，最终揭示蛋白质功能。蛋白质组学按照研究的内容可以分为：表达蛋白质组学和细胞图谱蛋白质组学。表达蛋白质组学研究在不同机体状态中细胞或组织中全部蛋白质的表达及其变化。细胞图谱蛋白质组学主要研究蛋白质间的相互作用，以明确细胞的信号转导通路的复杂机制等。,蛋白质组学研究的意义：,蛋白质是基因表达的最终产物和基因功能的实施者，有其自身特有的活动规律，例如，蛋白质的加工与修饰、转运定位、结构形成、代谢以及蛋白质分子之间复杂的相互作用等，均无法从基因组水平上的研究获知。基因组内各个基因的表达随着机体内外环境的变化呈现不同的表达模式。即表达产物的种类和数量受到严格的调控而表现时空特异性。不仅在同一机体的不同发育阶段有明显的差异，在机体的不同组织和不同细胞中，以及生理状态和疾病状态也各不相同。由于蛋白质翻译后的加工与修饰，基因和蛋白质不是1个基因对应1个蛋白质的关系。1个基因可以产生多种蛋白质，而且形式各异。所以，蛋白质数量比基因更大，相互作用也更复杂。mRNA的丰度并不一定与蛋白质表达产物有直接的关系。蛋白质组学研究是基因组学研究的重要补充和延伸。蛋白质组学的研究对揭示生命活动规律、探讨重大疾病机制、疾病诊断和防治以及新药的开发等提供重要的理论基础。,2蛋白质组学研究的几种重要的技术平台,（1）二维电泳（2）质谱技术（3）酵母双杂交（4）蛋白质芯片,（1）二维电泳,第一向是等电聚焦电泳，第二向是SDS-PAGE。第一向IEF电泳系统中含有高浓度的尿素和适量的非离子型去垢剂NP-40，而且蛋白质样品处理液中还需含有二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）。这些试剂可破坏蛋白质分子内的二硫键，使蛋白质变性，有利于第二向中蛋白质变性后的肽链与SDS充分结合；这些试剂本身并不带电荷，不会影响蛋白质原有的电荷量和等电点。第一向电泳结束后，凝胶柱用去离子水洗3次，再放入第二向SDS-PAGE的浓缩胶缓冲液含-巯基乙醇（-ME）和SDS中震荡平衡。-ME使蛋白质分子中的二硫键保持还原状态，以便蛋白质与SDS充分结合，从而完成第二向的样品处理。第一向电泳的环境温度保持在2035。尿素在低温时容易析出，在高温时容易分解。电泳后蛋白质的回收方法包括：扩散洗脱和电泳洗脱。,（2）质谱技术,基本原理质谱仪组成软电离技术基质辅助激光解吸电离源（MALDI）电喷雾电离源（ESI）质量分析器飞行时间（time of flight，TOF）分析器四极杆分析器 离子阱分析器,质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程,样品制备后进行2-DE分析。将感兴趣的蛋白质点从凝胶上切割下来。凝胶上的蛋白质经胰蛋白酶消化后，断裂成多个肽段。所得的肽片段质量用MALDI-TOP-MS或ESI-MS进行测定。将得到的肽质量指纹谱的数据在数据库中进行搜索。配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜。“冠军”蛋白质具有与未知蛋白质最相近的组分，从而进行蛋白质鉴定。,肽质量指纹谱（peptide mass fingerprint，PMF）由Henzel等人于1993年提出。原理：用酶（最常用的是胰蛋白酶）对由2-DE分离的蛋白质在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂，断裂所产生片段的精确分子量通过质谱来测量（MALDI-TOF-MS或ESI-MS）。所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比（理论肽是由实验所用的酶来“断裂”蛋白质所产生的）。配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜。质谱技术在蛋白质及多肽分析中的应用：蛋白质的鉴定磷酸化位点的分析,（3）酵母双杂交技术,酵母双杂交体系的基本原理：由于真核生物转录激活因子由两部分独立的结构域组成，即DNA结合结构域（DNA binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）。将与BD融合的已知蛋白质作为“诱饵”，与AD融合的另一待测蛋白质作为“猎物”。如果两种蛋白质在酵母细胞核内有相互作用时，则BD与AD靠近并激活报告基因的转录，借此可研究蛋白质间的相互作用。酵母双杂交系统的缺陷：不能检测到一些依靠翻译后修饰的相互作用（需用三杂交系统）。所得到的蛋白质相互作用信息可能存在“假阴性”或“假阳性”，还需通过进一步的验证加以确定和排除。该系统并非对所有的蛋白质都适用。由于有些蛋白质本身有激活转录活性，不经过双杂交相互作用就能激活报告基因的表达，因此酵母双杂交系统不适用。根据其原理，融合蛋白的相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的，而表达的融合蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内是检测的前提条件。虽然目前已经在表达质粒中插入了核定位序列，但仍不能排除不少必须经过内质网等细胞器进行翻译后加工修饰的蛋白质，尤其是胞外蛋白，不能进入核内。,酵母双杂交系统的发展,发展酵母菌株的多重筛选机制表达型载体的改进酵母接合型的引用Sos蛋白介导的双杂交系统/Sos救活系统（Sos recruitment system）反向酵母双杂交系统酵母三杂交系统,3.蛋白质组学在医药学中的应用,在基础医学和疾病机理研究中，应用蛋白质组学研究策略高通量地分析不同生长发育期；不同生理和病理条件下；以及不同细胞类型的蛋白质表达谱的变化，通过对相应蛋白质的鉴定及其功能进行研究，可能找到直接与特定生理或病理状态相关的分子，发现新的疾病诊断标志物及治疗靶点，从而有利于疾病的早期诊断和治疗。药物筛选：由于各种疾病的发生和药物治疗靶点大多数是在蛋白质（酶、受体或信号转导蛋白等）水平，蛋白质组学在寻找有效的药物靶点及新药开发方面有广泛的应用。通过比较正常状态和疾