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色谱分析,第一章 绪论第二章 经典柱层析第三章 平面色谱法第四章 气相色谱法第五章 高效液相色谱法第六章 其他色谱技术第七章 色谱分析样品处理,参考书目,傅若农 色谱分析概论达世禄 色谱学导论邹汉法 高效液相色谱法刘虎威 气相色谱方法及应用何丽一 平面色谱方法及应用,第一章 绪论,1.概述 混合物最有效的分离、分析方法 俄国植物学家茨维特于1903年研究植物色素时使用的示意装置：其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。,色谱法的出现,色谱法,利用混合物中各组分在两相间分配系数的不同,当两项作相对位移时，各组分在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而获得分离（各组分按一定次序由固定相中流出）。,与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础,色谱法的特点,（1）分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2）灵敏度高 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3）分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广 气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。不足之处：被分离组分的定性较为困难。,2.色谱法分类,气相色谱（流动相为气体）液相色谱（流动相为液体）柱色谱 平面色谱 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 排阻色谱,流动相物态,固定相使用形式,分离过程机制,流动相为气体（称为载气）固定相为固体吸附剂,气相色谱,气固色谱,气液色谱,流动相为气体（称为载气）固定相为液体,流动相为液体（淋洗液）固定相为固体吸附剂。,液相色谱,液固色谱,液液色谱,流动相为液体（淋洗液）固定相为液体,按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱,第二章 经典柱层析,1.吸附的分类 物理吸附（特点：无选择性；吸附与解吸可逆）常用的硅胶、氧化铝为这一类型；应用最广 化学吸附（特点：具有选择性；吸附十分牢固，甚至不可逆）如黄酮等酚酸性化合物被氧化铝吸附、生物碱被硅 胶的吸附；应用较少 半化学吸附（介于上述之间，如聚酰胺对黄酮、酚类、醌类的 氢键吸附）有一定应用,2.极性及其强弱判断极性强弱是支配物理吸附过程的主要因素所谓极性乃是一种抽象概念，用以表示分子中电荷不对称的程度，大体上与偶极矩、极化度、介电常数等概念相对应,官能团的极性强弱比较,3.吸附色谱吸附色谱法,是指用吸附剂作固定相,利用试样对吸附剂表面的吸附差异来进行分离分析的方法3.1 吸附色谱三要素（吸附剂、洗脱剂、试样）吸附剂一般是多孔性物质，具有较大的比表面积，在表面有许多吸附中心。常用的吸附剂有：硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性碳等,硅 胶,吸附性来源于硅羟基硅羟基有三种 结合型 活性型 游离型 三种硅羟基吸附性强弱为：硅胶吸附剂的缺点：对弱酸性敏感的化合物会被破坏,氧化铝,吸附性来源于铝原子上未公用电子对碱性吸附剂，适用于碱性（如生物碱）和中性化合物的分离缺点：有时会引起异构化、氧化、皂化、脱除氯化氢形成双键等副作用。,聚酰胺,通过形成氢键缔合而产生吸附；分子中的酰胺羰基作为质子受体；或以酰胺键上的NH作为质子给体；适用范围：酚类、黄酮类、醌类。,溶剂的极性,溶剂的极性:与介电常数大小一致 环己烷 1.88 苯 2.29 无水乙醚 4.47 氯仿 5.20 极性递增 乙酸乙酯 6.11 乙醇 26.0 甲醇 31.2 水 81.0,按照极性增强顺序，常用混合洗脱溶剂体系如下：(己烷/苯)(苯/乙醚)(苯/乙酸乙酯)(氯仿/乙醚)(氯仿/乙酸乙酯)(氯仿/甲醇)(丙酮/水)（甲醇/水）,三要素的相互关系,第三章 平面色谱法,第一节 TLC的特点、技术参数第二节 TLC的制板、点样、展开、显色第三节 TLC的定性与定量分析第四节 TLC的应用第五节 纸色谱简介,第一节 概 述,1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。1965年德国化学家Stahl出版了“薄层色谱法”一书，推动了这一技术的发展。因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪器化，并实现了计算机化。薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用。将试样点在色谱滤纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。,TLC特点,优点：设备简单、操作方便、运行费用低；分离时间短，工作效率高；展开剂选择范围广，展开方式多样；显色方便，检测手段丰富；既可分析，又可制备；试样一般不需要经过严格预处理即可分离。缺点：分离效率较低；不适用挥发性试样分离；定性定量不便。,TLC与高效液相色谱的比较,固定相和流动相TLC流动相流动靠毛细作用力，流动相选择较少受限制，固定相不用再生。而 HPLC是在封闭的系统内，流动相流量靠泵控制，溶剂选择受检测器限制，固定相需再生。样品处理TLC要求没有HPLC严格。,薄层色谱参数,比移值（Rf值）:用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，通常称作比移值，用Rf表示。,Ls,相对比移值,理论塔板数:n=16(D/W)2,理论塔板高度:H=L/n,分离度,分离数:,第二节 TLC的制板、点样、展开、显色,黏合剂：无机黏结剂石膏（硫酸钙），添加石膏的吸附剂以字母“G”表示。没有黏结剂的吸附剂以字母“H”表示。无机黏结剂的优点是：耐高温，耐酸碱，但涂铺薄板动作要快，否则匀浆易凝固;薄层强度差。有机黏结剂羧甲基纤维素钠（CMC-钠）、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。优点是薄层强度高、使用方便，缺点是不能用浓硫酸作显色。,添加剂 荧光指示剂 硝酸银溶液,制板、活化,点样,1.溶剂对样品的溶解度适中；2.溶剂沸点适中；3.样品浓度适中；4.原点位置应在展开剂液面上；5.定性分析:内径0.5mm管口平整的毛细管 定量分析:微量注射器,6.TLC:原点直径最大不超过5mm,一般3mm;高效TLC:1-2 mm7.边缘效应,边缘效应,展开剂选择的实践(一):微量圆环法,展开剂选择的实践(二):三角形法,展开剂选择的理论基础 展开剂的分类,显色,显色方法-日光下观察,划出有色物质的斑点位置-在紫外灯下(254nm或366nm),观察有 无荧光的产生,用硅胶G板-荧光淬灭法,适用于有紫外吸收的物质,用GF254板-显色剂显色,破坏性检出方法,通用显色剂,定性分析,与标准对照品在三种不同的展开剂中展开(加熔点)；制备TLC，将待定性化合物分离后，刮下、洗脱，再波谱分析；TLC与其它技术联用,定量分析,间接定量（洗脱测定法）；直接定量（薄层扫描法）薄层扫描法：以一定波长的光照射展开后的薄层色谱板上被分离组分的斑点，测定斑点对光的吸收强度或所发出的荧光强度，进行定量分析的方法。薄层吸收扫描法 薄层荧光扫描法,第四节 TLC的应用,1.用于柱层析后相同组分的合并 2.有机合成监控反应，摸索最佳条件 3.制备有机化合物 4.中药材的鉴定,第四章 气相色谱法,第一节 概述第二节 气相色谱术语、理论第三节 填充柱气相色谱第四节 毛细管柱气相色谱第五节 裂解气相色谱及顶空气相色谱第六节 气相色谱仪第七节 衍生化气相色谱法第八节 气相色谱的定性与定量第九节 气相色谱的应用,GC：以气体（即载气）为流动相的柱色谱分离技术。GC中常用作的载气的气体有N2、He、H2、Ar。GC中载气是惰性的，载气的功能仅仅是携带试样、洗脱组分。GC的选择性主要取决于固定相和组分分子间的作用，所以可通过改变固定相来改变GC的选择性。,第一节 概述,GC按柱直径粗细分类,填充柱：将固定相填充在内径4mm的金属管或玻璃管内毛细管柱：使用内径的玻璃管或石英管,GC按分离机理分类,GC的特点,分离效率高（填充柱上千块塔板；开管柱106块塔板）分析速度快样品用量少（检测限低，高灵敏检测器）缺点：（约20%样品适用）样品须能气化（350度下有一定的挥发性）热稳定性要好定性困难,第二节 气相色谱术语、理论,气相色谱流出曲线分配系数与容量因子塔板理论速率理论分离度基本分离方程,一、气相色谱流出曲线,1.基线 仅有流动相（无试样）通过检测器时，检测到的信号为基线。2.保留值,（1）用时间表示的保留值 保留时间（tR）：从进样到某个组分的色谱峰顶点之间的时间间隔 死时间（tM）：不被固定相滞留的组分从进样开始、通过色谱柱、到出现峰最大值所需要的时间。调整保留时间（tR）：tR=tRtM,(2)用体积表示的保留值,保留体积（VR）：VR=tRF0（F0为色谱柱出口处的载气流量，单位：m L/min。）死体积（VM）：VM=tM F0 调整保留体积（VR）：V R=VR VM,3.相对保留值r21,A.组分2与组分1的调整保留值之比(大于1）：r21=tR2/tR1=VR2/V R1=k2/k1=K2/K1B.它表示了固定相对这两种组分的选择性。C.亦称分离因子a、分配系数比、选择性系数、选择 因子,4.区域宽度,（1）标准偏差()：0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(Y1/2)：0.5倍峰高处的宽度 Y1/2=2.355（3）峰底宽(Wb)：Wb=4 Wb=1.699 Y1/2,二、分配系数与容量因子,分配系数K：组分在两相间的浓度比容量因子k：组分在两相间的质量比；容量因子k与分配系数K的关系为：,为相比：流动相体积与固定相体积之比填充柱的相比：535；毛细管柱的相比：50200,容量因子越大，保留时间越长。可由保留时间计算出容量因子，两者有以下关系：,三、塔板理论,塔板理论把色谱柱看成一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相（固定相与流动相）间的分配行为，并引入理论塔板数作为衡量柱效高低的指标。当组分进入柱后，组分在两相间进行多次分配，最后和固定相作用力较小的组分先从“塔顶”（即柱出口）逸出，从而与另一组分（和固定相作用力较大）分离,色谱塔板理论的五点假设,1.组分在气液两相间可瞬间完成分配平衡2.所有的物质在开始时全部进入零号塔板3.分配系数在每块塔板里都一样4.一个塔板和另一个塔板之间没有纵向扩散5.载气不是连续进入色谱柱，而是脉冲式进入色谱柱，即一个塔板体积的载气进入后，再进入另一个塔板体积的载气,理论塔板数的计算,色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：,有效塔板数、有效塔板高度,组分在死时间内不参与柱内分配，用调整保留时间代替保留时间，得有效塔板数和有效塔板高度：,塔板理论的成功与不足,塔板理论能成功解释色谱峰的形状（高斯分布曲线）及评价柱效（计算n）。不能解释柱效和流动相流速的关系；也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,四、速率理论,速率方程（也称范第姆特方程式）:H=A+B/u+Cu H：理论塔板高度(cm)，u：载气的线速度(cm/s),1.涡流扩散项A,A=2dp dp：载体颗粒的平均直径：填充不均匀因子（与载体颗粒大小、分布、填充均匀性等有关）,2.分子扩散项（纵向扩散项）B/u,B=2 Dg：弯曲因子（填充柱，=0.50.7；毛细管柱，=1）Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1）。由于柱中存在着浓度差，产生纵向扩散：,3.传质阻力项 Cu,组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻力。传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL，液相传质阻力大于气相传质阻力。即：C=（Cg+CL）,H u 曲线结论,涡流扩散项与流速u 无关；此曲线有一最低点，此点流速即uopt兼顾了分子扩散项和传质阻力项，使两者之和最小；在uopt附近曲线平坦，因此可适当提高流速以节省时间，同时板高H并没有增大多少；在低流速区,分子扩散项占主导,流动相使用重载气;在高流速区,传质阻力项占主导,流动相使用轻载气;采用较低固定液量,H=A+B/u+Cu,Uopt Hmin 计算公式,五、分离度,塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。分离度的表达式：,定性时要求：R=1.0（相邻两峰分离程度98%）定量时要求：R=1.5（相邻两峰分离程度99.7%，基线分离，作为完全分离的标准）。,六、基本分离方程,初始,k、N、对分离度的影响,增大k,增大N,t,改变,第三节 填充柱气相色谱,填充柱气相色谱用载体气液色谱用固定相气固色谱,气-液色谱的特点：,(1)固定液品种多，可选择范围大；(2)可以根据需要选用合适的固定液用量，以改善分离效果；(3)气-液色谱在通常操作条件下有良好的对称峰；寿命长。,气液色谱固定相：固定液+载体（担体）载体，亦称担体，是支撑固定液的惰性多孔物质,填充柱气相色谱用载体,作为担体使用的物质应满足的条件：比表面积大，孔径分布均匀；化学惰性，表面无吸附性或吸附性很弱，与被分离组份不起反应；具有较高的热稳定性和机械强度，不易破碎；颗粒大小均匀、适度。一般常用6080目、80100目。,载体分类：硅藻土：由二氧化硅（90%）和少量金属氧化 物组成 红色硅藻土：201红色担体 白色硅藻土：101白色担体 非硅藻土类：GDX、玻璃微球、氟担体等,按相对极性分类固定液分类 按化学结构分类,固定液分类：按相对极性分类,“0”级非极性固定液“+1”与“+2”级弱极性固定液“+3”级中等极性固定液“+4”与“+5”级强极性固定液,固定液分类：按化学结构分类,烃类聚硅氧烷类聚二醇类聚酯类腈类特殊的固定液,按固定液的化学结构分类的固定液,固定液与组分的分子间作用力,1.定向力：2.诱导力：3.色散力：,气固色谱固定相的特点,（1）性能与制备和活化条件有很大关系；（2）同一种固定相，不同厂家或不同活化条件，分离效果 差异较大；（3）使用方便；（4）种类有限，能分离的对象不多。,气固色谱中常用的吸附剂,特点：可控制其孔径大小及表面性质；易填充均匀，重现性好。用途：有机物中痕量水，多元醇、脂肪酸、胺类。非极性：苯乙烯、二乙烯苯共聚种类：极性：苯乙烯、二乙烯苯共聚中引入极性官能团,高分子多孔小球,第四节 毛细管柱气相色谱,毛细管气相色谱法的特点,柱渗透性好 柱效高使用温度较高，固定相流失小 柱容量小易于实现气-质联用（GC-MS）,毛细管柱速率方程,H=B/u+Cu H：理论塔板高度(cm)，u：载气的线速度(cm/s)B=2 Dg：弯曲因子（填充柱，=0.50.7；毛细管柱，=1）,毛细管柱的分类,涂壁开管柱（WCOT）壁处理开管柱（WTOT）多孔层开管柱（PLOT）开管柱 载体涂渍开管柱（SCOT）键合、交联毛细管 熔融氧化硅开管柱（FSOT）填充柱,毛细管气相色谱柱的粗糙化、钝化,毛细管在涂敷固定液前，应进行表面处理，其目的：（1）粗糙化，提高表面的可润湿性；（2）钝化，去除表面硅羟基的活性玻璃柱的粗糙方法：化学反应法、沉积细颗粒法、玻璃管预处理法石英柱的粗糙方法：沉积石墨化炭黑；沉积氯化钠；沉积二氧化硅钝化方法：硅烷化试剂（二甲基二氯硅烷、六甲基二硅烷胺）、PEG、表面活性剂钝化,固定液的涂敷,涂敷指的是在整个色谱柱的内壁形成均匀的薄层，其厚度一般为0.11.5m，可采用动态法和静态法,石英毛细管柱,一支高性能的毛细管柱应具备四个方面的优良性能：柱效高、活性低、热稳定性好、保留性能重复性好毛细管柱对固定液的要求：热稳定性好、对毛细管内壁有交好的润湿性、批与批之间尽可能一致（分子结构、分子量分布）、对组分选择性高（K差别大）通常，具备非极性的OV-1（SE-30）、弱极性的SE-54、中等极性的OV-17）三种毛细管柱可完成85%以上的GC分析任务；再加一根强极性的（PEG-20M）可完成95%以上的GC分析任务,第五节 裂解气相色谱及顶空气相色谱,裂解气相色谱,裂解气相色谱：是热裂解和气相色谱两种技术的结合。可用于分子量较大、结构复杂、难挥发的物质的分析鉴定。在高分子、生物医学、考古学、地球化学、炸药等领域有广 泛应用。,裂解气相色谱基本原理及方法,基本原理：在一定条件下，高分子及非挥发性有机化合物遵循一定的裂解规律，即特定的样品能够产生特征的裂解产物及产物分布，采用气相色谱分析鉴定裂解产物，据此可对原样品进行表征。方法：样品置于裂解器中，在严格控制的条件下，快速加热，使之迅速分解成为可挥发的小分子产物，然后直接将裂解产物送入色谱柱中进行分离，获得定性定量数据。,裂解气相色谱的特点,(1)分离效率高(2)灵敏度高、样品用量少(3)分析速度快、信息量大 快速裂解、快速分析；不丢失信息；(4)适合于高聚物、生物大分子和不挥发性有机物 如固化树脂、涂料、硫化橡胶、塑料等(5)设备简单,顶空气相色谱,顶空气相色谱：对液体或固体试样中的挥发性成分进行气相色谱分析的技术；将试样置于密闭的恒温系统中，待气-液（气-固）两相达到热力学平衡时，测定气相组成。,两种方式：静态法：恒温密闭系统，平衡时，测定气相组成；动态法：吹扫-捕集法，采用吸附剂吸附，加热解吸。,第六节 气相色谱仪,气路系统进样系统色谱柱系统检测系统数据处理和控制系统（含温控系统）,GC分析流程,气相色谱仪组成,气路系统,提供高纯、流速稳定、封闭的载气；包括气源、净化器和载气流速控制器；净化器：载气流速控制：压力表、流量计、针形稳压阀，控制载气流速恒定。,载气,载气的种类：氢气、氮气、氦气、氩气载气的流速 H=A+B/u+Cu载气为何要净化,进样系统由进样器和气化室构成。液体样品微量注射器 气体样品六通阀、微量注射器气化室温度：要保证样品瞬间、完全气化，一般 高于沸点50以上，但也不宜太高，以防分解,液体进样器：,不同规格的专用注射器，填充柱色谱常用10L；毛细管色谱常用1L,气化室：将液体试样瞬间气化的装置；惰性，无催化作用。,填充柱、毛细管柱的比较,毛细管柱具有较高的分离效率，表现为峰形尖而窄，柱效高，可以将填充柱分离不开的两个峰完全分离开。毛细管色谱的优越性还表现在对痕量物质的分析上，其检测限已达到Pg以下。,柱温的选择柱温应低于固定液的最高使用温度；柱温过高，易造成固定液流失、检测器噪声变大、基线漂移。柱温一般选择接近或略高于组分的平均沸点。柱温：分离度，分析时间。降低柱温可在一定程度内改善分离；升高柱温可加快分析速度。组分复杂，沸程宽（80-100）的试样，采用程序升温。,程序升温,程序升温：在一个分析周期内，按一定程序改变柱温，从而使宽沸程（80-100）、多组分样品达到较好的分离效果。,检测器分类浓度型检测器：检测信号值与组分的浓度成正比。质量型检测器：检测信号值与单位时间内进入检测器组分的质量成正比。通用型检测器：对所有物质有响应选择型检测器：对特定物质有高灵敏响应,对检测器的要求,稳定性好、噪声低；灵敏度高；线性范围宽；死体积小，响应快,噪声和漂移噪声（N）：在没有样品进入检测器时，基线在短期内发生的波动。噪声的来源：固定液的流失、载气的不纯，电子元件不稳定、温度变化、外磁场干扰等。,基线漂移：基线在一定时间内产生的单向、缓慢移动。良好的检测器其噪声与漂移都应很小,灵敏度灵敏度（S）：待分析样品通过检测器时，物质量的变化对响应信号的变化率。S=R/Q式中：R为响应信号的变化，Q为物质量的变化,检测限,检测限（D）：亦称敏感度，规定检测器恰能产生2倍于噪声的信号时，单位体积或单位时间引入检测器的样品量。D=2N/S 式中：N为噪声，S为灵敏度浓度型检测器：Dc的单位是mg/mL质量型检测器：Dm的单位是g/s,线性范围：指被测物质的量与检测器响应信号（R）之间成线性关系的范围；在线性范围内，以最大允许进样量与最小进样量的比值来表示。这个范围越大，越有利于准确定量。,线性范围,第七节 衍生化气相色谱法,衍生化气相色谱法的定义衍生化的目的衍生化反应需满足的条件常用的衍生化方法,衍生化的定义,衍生化的目的(1),衍生化的目的(2),衍生化应满足的条件,气相色谱中常用的衍生化方法,硅烷化酯化酰化,第八节 定性与定量分析,定性分析,用标准品对照定性据经验式定性（碳数规律、沸点规律）据相对保留值i,s定性据保留指数定性双柱或多柱定性与其它仪器联用定性,用已知纯物质对照定性,方便，可靠。在一定操作条件下，各组分的保留时间是一定值的原理。也可采用在样品中加入标准物，看哪个峰增大来定性。,据经验式定性:碳数规律,在一定温度下，同系物的调整保留时间的对数与分子中碳原子数成线性关系，即：（n3）式中，A和C是常数，n为分子中的碳原子数,据经验式定性:沸点规律,同族具有相同碳数的异构体，其调整保留时间的对数和它们的沸点呈线性关系，即：,式中，A和C均为常数，Tb为组分的沸点（K）。,据相对保留值i,s定性,用保留值定性要求两次进样条件完全一致，要求较苛刻；而用i,s定性，只要温度一定即可。做法：在样品和标准品中分别加入同一种基准物s，将样品的i,s和标准品的i,s相比较，来确定样品中是否含有i组分。i,s=tRi/tRs,据保留指数（Kovats指数）定性,将待测组分的保留行为换算成正构烷烃的保留行为。重现性好；当固定液、柱温一定时，通过与文献值对照定性，而不需标准品。将待测物X的调整保留时间介于两个正构烷烃的调整保留时间之间，按公式计算(式中，n为碳数)：,双柱、多柱定性,不同的组分有可能在同一色谱柱上具有相同的保留值；可克服在一根柱子上，不同物质可能出现相同的保留时间的情况；,与其他仪器联用来定性,气相色谱与质谱、Fourier红外光谱等仪器联用是目前解决复杂样品定性分析最有效工具之一。,定量分析,峰面积测量,高斯峰 A=1.065 h Y12 不对称峰 A=1/2 h（Y0.15Y0.85）自动积分仪,定量校正因子,同一检测器对质量相同的2种不同物质具有不同的响应值，峰面积不同将面积乘上校正因子，使之能代表相应物质的量相对质量校正因子：mi:组分i的质量，ms:基准物s的质量 Ai:组分i的峰面积，As:基准物s的峰面积,面积归一化法,优点：A.不需要标准品；B.对操作要求不严。缺点：A.所有组分必须全部出峰；B.所有组分必须知道相对校正因子面积归一化的计算公式：,外标法特点,优点：A.不需要校正因子；B.不需要所有组分都出峰(待测组分要出峰)缺点：A.对进样量、操作条件要求严格，否则重复 性差；B.需待测组分的标准品,外标法分类,1)标准曲线法 将待测组分的标准品配成一系列浓度的标准溶液，在相同条件下，以相同体积准确进样，作出A（峰面积）和C（组分浓度）的标准曲线；再将待测组分在相同条件下进样，得峰面积，查上述标准曲线，得其浓度。2)外标单点法 实际应用，只配制一个标准溶液，但其浓度尽量与被测物接近 C样=（A样/A标）C标,对内标物的要求,纯度高；不是试样中的组分；与各组分完全分离（且保留时间与待测组分接近）与样品混溶性好化学结构与待测组分相似,内标法特点,优点：1）不是所有组分都出峰；2）定量结果重复性好，操作要求不严格缺点：内标物寻找困难,内标法计算,在样品中加入一种纯物质作内标物，则待测组分i的质量分数为：mis：内标物质量，m：样品质量fi：组分i的相对校正因子，fis：内标物的相对校正因子Ai：组分i的峰面积，Ais：内标物的峰面积,第九节 GC的应用,石油和石油化工分析,环境分析,食品分析,药物和临床分析,物化参数测定,聚合物分析,第五章 高效液相色谱法,概述 HPLC基本概念、理论 液固色谱法 液液色谱法 化学键合相色谱法 排阻色谱及离子交换色谱 HPLC手性分离 高效液相色谱仪 衍生化技术 定性与定量 HPLC的应用,第一节 概述,HPLC与GC比较,GC：适于能气化、热稳定性好的样品；约 占有机物的20%；HPLC：不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的 样品均可检测，约占有机物的80%,高效液相色谱法的基本类型,一、吸附色谱法二、分配色谱法三、离子交换色谱法四、空间排阻色谱法,第二节 HPLC基本参数、理论,速率理论,涡流扩散项,分子扩散项,固定相传质阻力项,移动流动相传质阻力项,HMM=W(dp2/Dm)U W：与填充有关的系数 dp：粒径 Dm：溶质在流动相中的扩散系数,滞留流动相传质阻力项,第三节 液-固色谱法 一、引言 也称吸附色谱法，是液相色谱中发展历史最长的一种方法。适用范围：1.具有中等分子量的油溶性样品；2.具有不同极性取代基的化合物；3.对几何异构体、立体异构体具有较高的选择性 不适用范围：1.对强极性、离子型的样品，有时会发生不可逆吸附；2.对同系物分离效果差。,二、分离原理：溶质分子与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心,利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离。,三、固定相,1.分类 酸性：硅胶、硅酸镁 极性吸附剂（表面PH5）碱性：氧化铝、氧化镁固定相（表面PH1012）非极性吸附剂：活性碳,2.硅胶（1）薄壳型（表面多孔型），60年代初，在直径3040m的玻璃珠表面涂布一层1 2m厚的硅胶微粒。缺点：对样品的负载量低（0.1mg/g)（2）全多孔型（310m），70年代后，负载量大（mg/g级),表征固定相性质的参数,四、流动相,1.对流动相的要求,2.溶剂强度参数,液-固色谱中常用溶剂强度参数来表示溶剂的洗脱强度。提示：当洗脱强度太强（k值过小），更换 为值小的溶剂 当洗脱强度太弱（k值过大），更换 为值大的溶剂,一些溶剂的值,提高分离度的途径,选择合适的固定相选择合适的流动相 k:一般(110),多组分可0.5 20 a1.05梯度洗脱,第四节 液-液色谱法,一、分离机制：液-液色谱法，又称液-液分配色谱法，即一种液相为流动相，另一种液相则涂渍在惰性载体表面上作为固定相，两者互不相溶，利用样品在固定相与流动相中的分配系数不同，而实现分离。,二、分类：,1.正相液液色谱 固定相极性流动相极性；主要用于分离极性化合物；流出顺序：极性小的组分先流出，极性大的 组分后流出。2.反相液液色谱 固定相极性流动相极性；主要用于分离油溶性化合物；流出顺序：极性大的组分先流出，极性小的 组分后流出。,第五节 化学键合相色谱,一、化学键合固定相特点二、化学键合固定相的制备三、化学键合固定相的种类四、流动相的选择五、分离机制,定义,化学键合固定相：利用化学反应将不同的有机官能团通过共价键键合到载体硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相。化学键合相色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法。,化学键合相色谱法之特点,解决了固定液流失的问题（耐溶剂冲洗）；固定相柱效高，并使固定相的功能得到了改善（键合不同的官能团，提高了选择性）；热稳定性好（70以下稳定）；化学性能稳定（柱子不娇、在PH28中稳定）；适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件。,二、化学键合固定相的制备,二、化学键合固定相的制备,（l）形成 键 这类是最早用于液相色谱的键合固定相，用醇与硅羟基发生硅醚化反应。制法：缺点：易水解、热稳定性差，现少用。,制法：比SiOC键稳定（热稳定性、抗水解性）；适用于pH在48介质中.,（2）形成SiC键或Si一N键,（3）形成SiOSiC键,制法：这类化学键牢固、耐有机溶剂、耐热；能在70以下，PH=28范围内正常工作，应用较广泛；是制备化学键合固定相最主要方法。,三、化学键合相种类,非极性键合相：如键合C18、C8、苯基等，其中十八烷基（ODS或C18）键合相是常用的代表，可完成HPLC分析任务的80%。2.中等极性键合相：如键合醚基，可分离能形成氢键的化合物（如酚类）,3.极性键合相（1）氨基键合相：分析糖类最常用的固定相（单糖、双糖、多糖）注意：不宜分析含羰基的化合物，流动相也不能含羰基。（2）氰基键合相：对酸性、碱性样品可获得对称的色谱峰；对含双键的异构体或含有不等量双键数的 环状化合物有较好的分离能力（3）二醇基键合相：可分离有机酸,四、流动相的选择,正相液相色谱的流动相选择在正相色谱中，首选溶剂为乙醚（组）、氯仿（组）与二氯甲烷（组），P值最小的正己烷为底剂；乙醚易产生气泡，可由沸点高的其他醚类代替。为改善分离度，可使用多元溶剂系统，一个溶剂系统中，不宜有两个相同组别的纯溶剂。溶剂洗脱能力用极性参数P描述。,正相色谱的溶剂极性参数P,二元溶剂系统的溶剂强度因子 Pab=Paa+Pbb Pa、Pb：纯溶剂a,b的极性参数 a、b：纯溶剂a,b的体积分数,2.反相色谱法的流动相选择（1）反相液相色谱的溶剂参数（用强度因子S 值描述）,反相洗脱溶剂的强度因子S值,在正相洗脱时，水洗脱能力最强；在反相洗脱时，水洗脱能力最弱；冲洗能力：THF乙腈甲醇水二元溶剂系统的溶剂强度因子 Sab=Saa+Sbb Sa、Sb：纯溶剂a,b的强度因子a、b：纯溶剂a,b的体积分数,（2）二元溶剂体系 一般以洗脱力最弱的水为底剂，再加入与水互溶的有机极性调节剂如甲醇、或乙腈，组成一定比例的甲醇-水、或乙腈-水为流动相。甲醇/水体系：对易形成氢键的极性样品选择性 高，冲洗能力强；乙腈/水体系：对含有双键的样品选择性高和分 离效率高；THF/水体系：对其他样品和非极性化合物冲洗 能力强,（3）多元溶剂体系在甲醇-水、或乙腈-水体系中加入少量的THF，常能改善某些难分离的物质对的分离度；若某些色谱峰拖尾，可加入减尾剂，如三乙胺等；用水、甲醇、乙腈、THF组成四元溶剂体系，并进行优化，选出最佳溶剂体系,Synder溶剂分组,Synder溶剂分组,五、分离机制,疏溶剂理论,A.当溶质分子被流动相推动与固定相接触时，溶 质分子中的非极性部分会将非极性固定相上附 着的溶剂膜排挤开，并与之形成缔合物；B.这种疏溶剂的斥力作用是可逆的，当流动相极 性减小时，这种疏溶剂斥力下降，发生解缔，并将溶质分子释放下来。C.缔合作用与解缔作用之差，决定了保留值。,反相离子对色谱法定义,反相离子对色谱法：把离子对试剂加入极性流动相中，被分析的样品离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不荷电的中性离子对(离子对模式说)，从而增加了样品离子在非极性固定相中的溶解度，使分配系数增加，改善分离效果。,分析酸类物质：用季铵盐作离子对试剂，如四丁基铵磷酸盐（TBA）和溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）等；分析碱类物质：用烷基磺酸盐作离子对试剂，如正戊烷基磺酸钠（PICB5）、正己烷基磺酸钠（PICB6）等；,离子对试剂的选择与分离机理,用途,使反相色谱法得以用于有机酸、碱、盐的分离，如生物碱、有机酸、磺胺类药物、某些抗生素与维生素等。,体积排阻色谱分类,用途,1.分离机制：凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。,分离机制：离子交换色谱是以离子交换剂作为固定相，其上有固定的离子基团及可交换的离子基团，当流动相带着组分通过固定相时，组分离子与离子交换剂上可交换的离子基团进行交换，根据组分离子和离子交换剂离子交换能力的不同而得到分离。,R,基质,流动相,可交换离子,固定离子,分离条件的选择,第八节 高效液相色谱仪,高效液相色谱仪流程图,储液器,流动相脱气的方法（一）,流动相脱气的方法（二）,流动相脱气的方法（三）,对流动相溶剂的要求,（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。表20-2列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。,（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50IOOnm。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。(5)低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.,HPLC用水,1 专门的纯水机或超纯水机；2 二次或三次重蒸水；3 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水；4 其它途径；,对输液泵的要求：,无脉冲、流量恒定、流量可以自由调节、耐高压、腐蚀、适于进行梯度洗脱,基本要求1 流速稳定2 流量可调3 耐高压4 死体积小5 耐腐蚀,常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。,恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；,恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差,目前，恒流泵比恒压泵优越，使用较普遍,输液泵的类型,流动相的过滤,洗脱方式,等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）用恒定配比的溶剂系统洗脱梯度洗脱在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的浓度配比。优点：缩短分析周期；提高分离效果；改善峰形；增加检测灵敏度。缺点：有时引起基线漂移；重复性不佳。,梯度淋洗装置,高压梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,低压梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,HPLC 色谱柱类型,评价色谱柱好坏的标准,1）理论塔板数N 2）拖尾因子Tf 3)色谱柱批与批之间的重现性 4）pH值的适用范围 5）使用寿命,拖尾因子Tf,色谱柱的再生,反相色谱柱：以甲醇-水（95：5）、纯甲醇、一氯甲烷为流动相，依次冲洗，每种流动相的冲洗体积为20倍柱体积；然后，再以相反顺序依次冲洗。正相色谱柱：以脱水的正己烷、异丙醇、一氯甲烷及甲醇为流动相，依次冲洗，每种流动相的冲洗体积为20倍柱体积；然后，再以相反顺序依次冲洗。,对理想检测器的要求,高灵敏度；适用范围广，对所有组分都有响应；温度、流动相流速的变化对响应没有影响；可梯度洗脱，响应与流动相的组成无关；死体积小；使用方便、可靠、耐用；线性范围宽；响应时间快；,紫外检测器（UV）,配置最普遍；主要用于检测具有-、p 共轭结构的化合物，如芳烃、稠环芳烃等；灵敏度高；可用于梯度洗脱缺点：只能检测有紫外吸收的样品；（衍生化解决）对流动相的选择有一定的限制；（截止波长）,荧光检测器（FD）,适用于能产生荧光的化合物；主要用于氨基酸、多环芳烃等样品；灵敏度极高（比紫外高13个数量级），适用于痕量分析；可梯度洗脱缺点：许多化合物不产生荧光（可衍生化解决）；,示差折光检测器（RID）,通用性好；对糖类分析灵敏度尚可；缺点：灵敏度低（比紫外低3个数量级）；不能梯度洗脱（否则，基线会漂移）,蒸发光散射检测器（ELSD）,20世纪90年代新开发；通用型，是示差折光检测器的理想替代品，对葡萄糖最小检出量5 ng；高灵敏；可梯度洗脱；缺点：对有紫外吸收的样品，检测灵敏度较低；,检测器比较,HPLC定性、定量分析,定性分析（1）利用保留值定性；（2）色谱-光谱联用定性；HPLC-MS，HPLC-NMR（3）利用馏分收集器收集后，再用光谱定性；,2.定量分析（1）归一化少用；（2）外标法：（3）内标法：,外标法：以待测组分的纯品作对照物质，对比求试样含量。工作曲线法、外标一点法、外标二点法进样量必须准确，否则误差大。,内标法（内标物的选择）工作曲线法内标一点法内标二点法内标对比法（最常用）校正因子法优点：使用内标法可抵消仪器稳定性差、进样量不够准确带来的误差。,