第六章一般毒性1.ppt

第六章 一般毒性作用（General Toxicity of Xenobiotics）,汪春红027-68759956,补充参考书,周宗灿，付立杰主编.现代毒理学简明教程.军事医学科学出版社，2012卡萨瑞特 道尔著.毒理学基础周宗灿主编.毒理学教程（第3版）.北京大学医学出版社，2006,All substances are poisons,there is none which is not a poison.The right dose differentiates a poison and remedy.No substance is a poison by itself.It is the dose that makes a substance a poison.Paracelsus(1473-1548)欧洲医生，医药化学运动的始祖所有物质都是毒物，没有不是毒物的物质，唯有剂量使之区分为毒物还是药物 物质本身不是毒物，主要是剂量才使一个物质变成毒物,毒性评价或安全性评价的基本目的,受试物毒作用的表现和性质剂量反应（效应）研究确定毒作用的靶器官确定损伤的可逆性其它：敏感检测指标和生物学标志、毒作用机制、毒物动力学、中毒的解救措施,毒性试验的设计不是为了证明化学品的安全性，而是为了表征化学品可能产生的毒作用。,第一节 概述（毒理学实验基础）,描述毒理学是以动物中毒模型（model）模拟/预测人中毒原型（prototype），实验动物体内实验是常规试验。,gy,外推,A.人是最敏感的物种B.人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢与体重（或体表面积）相关。以单位体表面积计算在人产生毒作用的剂量和实验动物相近，以体重计算则人通常比实验动物敏感，差别可达10倍。如果某一化学物对几个物种实验动物的毒性是相同的，则人的反应也可能是相似的,毒理学研究方法,体内试验体外试验,人体观察流行病学研究,动物实验,人群调查,以实验动物为模型，最终目的是通过外源化学物对实验动物的毒性反应，向人(原型)外推，以期评估外源化学物对人的危害及危险性。,筛选和预测急性毒性和机制研究,进一步深化和证实在动物实验中所得到的资料,动物实验,整体动物实验（in vivo）,体外试验（in vitro）,一般毒性试 验,特殊毒性试 验,微 生 物试 验,哺乳动物试 验,急性毒性重复剂量毒性亚慢性毒性慢性毒性,致突变致癌致畸,致突变,器官水平组织水平细胞水平亚细胞水平分子水平,实验动物单次、多次或长期染毒所产生的综合毒性效应,以动物实验为中心，动物实验的设计、实施、结果观察和评价是毒理学研究 的基本功,Lumley(1990)/Igarashi(1994)根据有限的临床资料报告对人的毒性约一半不能由临床前（动物）毒性研究预测。Heywood（1983）报告27个化学物（多为药物）的靶器官毒性在大鼠和狗（或猴）之间的相符率仅20%。Olson等（1998）报告131种化学物对动物的毒性与人的毒性的相符率，啮齿类6%，非啮齿类28%，合并达36%，所有物种相符率可达69%。按照目前的广泛进行毒理学安全性评价，可在一定程度上提高新药和各种化学品的使用安全性，但仍不能完全排除对人健康危害的风险WHO在临床前药物安全性实验原则的文件中指出：虽然事先对生物活性物质进行了最仔细彻底的研究，但给人使用时总是不可能避免地要冒一定的风险,基本假设为：人是最敏感的动物物种；人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢，与体重(或体表面积)相关。这两个假设也是全部实验生物学和医学的前提。以单位体表面积计算在人产生毒作用的剂量和实验动物通常相近似。而以体重计算则人通常比实验动物敏感，差别可能达10倍。,2.实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需的和可靠的方法。,描述毒理学实验的基本原则,1.化学物在实验动物产生的作用可以外推于人,此原则是根据质反应的概念，随剂量或暴露增加，群体中效应发生率增加。,选用成年的健康(雄性和雌性未孕)实验动物是为了使实验结果具有代表性和可重复性。以成年健康实验动物作为一般人群的代表性实验模型，而将幼年和老年动物、妊娠的雌性动物、疾病状态作为特殊情况另作研究。这样可降低实验对象的多样性，减少实验误差。,3.成年的健康(雄性和雌性末孕)实验动物 和人可能的暴露途径是基本的选择,外源化学物以不同途径染毒，实验动物表现的毒性可有很大差异。因此，毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人接触该受试物的方式。,毒理学实验的局限性（不确定性）,WH0在临床前药物安全性实验原则文件中指出“虽然事先对生物活性物质进行了最仔细彻底的研究，但给人使用时总是不可避免地要冒一定的风险。”这就是利用动物实验的局限性。,1、实验动物结果外推到人的不确定性。实验动物和人对外源化学物的反应敏感性不同，有时甚至存在着质的差别。,2、高剂量结果向低剂量外推的不定期性。,4、小数量实验动物结果外推大数量人群的不确定性。毒理学实验所用动物数量有限，那些发生率很低的毒性反应，在少量动物中难以发现。,5、一般人群结果外推易感人群的不确定性,3、异质性小的群体外推异质性大的不定期性。,6、不同暴露方式（途径、期限、频率）的结果的外推不确定性,1统计原则,随机：代表性对照：鉴别处理因素与非处理因素的差异及处理因素效应大小，消除和减少随机化原则所不能控制的抽样误差及实验者操作熟练程度等造成的差异 空白/阴/阳性对照，自身对照，历史性对照重复：样本量、重复次数,实验设计过程应遵循基本原则,2动物选择原则,首先考虑代谢与毒性效应上与人一致注重对受试物毒性敏感的动物物种种属、品系、个体差异自然寿命不太长、易于饲养和实验操作、经济易获得动物年龄、性别,毒理学实验设计基本原则,没有一种实验动物完全符合物种选择的原则，目前常规选择2个物种：啮齿类+非啮齿类,急性毒性试验：大鼠、小鼠、狗亚慢性、慢性：大鼠、狗皮肤刺激试验和致敏试验：兔、豚鼠眼刺激试验：兔遗传毒理学试验：小鼠致畸试验：大鼠、小鼠、兔致癌试验：大鼠、小鼠迟发性神经毒性试验：母鸡,为什么常选大、小鼠呢？,因为它的毒性反应与人较为一致，而且繁殖快、易饲养、价格便宜且易获取。使用实验动物来推论于人必须慎而慎之。因为动物的反应敏感性一般不及人。曾有报导发现有138种化合物人对之反应比大鼠更为敏感。,人与大鼠对不同化合物的急性毒性敏感比值,*以大鼠为1，人：大鼠,另外，由于不同种属动物其生理状况不一，在做实验时要根据实验需要注意：啮齿类动物：无呕吐反应猫、狗：呕吐反射灵敏，可用于研究引发呕吐的实验兔、豚鼠：多用于经皮肤接触的毒作用研究。猴：用于一些特殊的实验。,实验中小动物至少应为清洁动物及以上级别，国际上SPF动物已成为毒理学实验的标准实验动物。,实验动物微生物等级标准,3剂量分组原则,实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需和可靠的办法。除对照组外，一般设3个或3个以上剂量组，以观察剂量-反应(效应)关系，确定受试化学物引起的毒效应及其毒性参数。,高剂量组：应出现明确的有害作用，或高剂量组已达到极限剂量或染毒的最大剂量低剂量组：应不出现任何可观察到的有害作用（即相当于NOAEL），但应当高于人可能的接触剂量，至少等于人可能的接触剂量中剂量组：介于高低剂量组之间，应出现较轻的毒性效应（相当于LOAEL）三组剂量一般按等比例计算，低剂量组一般为高剂量组的1/10-1/20,4试验期限,一般由毒性实验的定义决定：急性毒性：一次或1d内多次观察14d 亚慢性毒性：持续至实验动物寿命的10%（大/小鼠90d，狗1年）某些试验（如致畸和多代生殖试验）由受试实验动物物种或品系决定。,5给受试物途径,尽可能利用人拟用途径 吸收速率：静脉注射吸入腹腔注射经口经皮,质量控制,优良实验室规范（good laboratory practice，GLP）：严格控制可能影响实验结果准确性的各种主客观因素，降低试验误差，确保实验结果的真实性 实验操作规程、试剂/动物选择、仪器使用、实验环境 安全性评价的最终产品并没有实体，而是数据。因此，难以通过检查最终产品来保证其质量，只有通过保证有关安全性试验的计划、实施等所有的因素和过程的可靠性才能保证最终产品的可靠性,毒理学实验结果评价,统计学意义生物学意义毒理学意义,统计分析,是否具有统计学意义是否具有生物学意义，即是否是真实的效应是否具有毒理学意义，即是否是有害效应,有统计学意义无生物学意义,有统计学意义有生物学意义,无统计学意义无生物学意义,无统计学意义有生物学意义,I,II,IV,III,毒理学实验结果评价,统计学意义生物学意义毒理学意义,在判断生物学意义时应先考虑：剂量依赖性趋势 结果的重现性 相关指标结果的一致性 差别的大小和类型 两种性别的一致性,一般毒性,外来化学物在一定剂量、一定接触时间和接触方式下对试验动物产生的综合毒效应，即基础毒性特殊毒性：致癌、致畸、致突变 生殖发育毒性,污染物理化特性,了解毒性大小和特征,了解在体内蓄积和耐受,了解对机体毒作用靶点和指标,确定阈和阈下剂量,急性毒性试验,亚急性毒性试验,亚慢性毒性试验,慢性毒性试验,一般毒性试验,外源化学物对全身各系统的毒性效应全身各系统对外源化学物的毒性反应,目的要求,掌握一般毒性作用的概念、试验目的熟悉一般毒性试验方法要点熟悉蓄积毒作用概念了解蓄积毒作用研究方法,第二节 急性毒性作用acute toxicity,机体一次或24h内多次接触外源化学物后在短期内（最长14天）所产生的毒性效应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应,一、急性毒性的概念,急性毒性（acute toxicity）,急性毒性的概念,需要注意,急性接触的次数 一次:经口、注射；呼吸道、皮肤(一段时间)24h多次（不超过3次）中毒效应出现的时间 不能仅以接触毒物后毒性症状出现的时间，主要以接触毒物的时间，观察时间：714天强度 一次性大剂量，中毒症状明显，常发生死亡,二、急性毒性试验的目的,求出致死剂量及其他急性毒性参数观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物的毒效应特征、靶器官、剂量-反应（效应）关系 等为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据为毒理学机制研究提供线索,急性毒性的参数半数致死剂量：LD50,GB15193.3-2003食品安全性毒理学评价程序和方法的急性毒性分级标准,急性毒性危害类别和急性毒性估计值（GHS）（WHO-全球化学品统一分类和标签制度）,急性毒性的参数剂量-反应曲线ED,TD：ED50,TD50,（1）霍恩法（Horn）（2）改进寇氏法（3）Bliss法 最大似然性法（maximum likelihood method），最精确的计算方法,LD50的几种计算方法,（1）霍恩法（Horn）：（剂量递增法/平均移动法）剂量对数与死亡率（反应率）的转换数（概率单位）呈直线关系。简单、精确度不够！4个剂量组，每组动物数相等（4-5只），剂量按等比级排列一般为2个参考染毒系列：剂量组距为2.15倍或3.16倍根据每组动物数、组距、每组动物死亡数，查表求出受试物LD50、95%CI,LD50的几种计算方法,（2）改进寇氏法（Karber法/平均致死剂量法）,利用剂量对数与死亡率呈S型曲线而设计的方法该法计算简便，准确率高，较为常用要求：每组动物数相同、至少5个实验组、各剂量组组距呈等比级数、死亡率呈正态分布、最低剂量组死亡率80。,lgLD50及其95可信限为1.35211.960.02131.35210.0417LD50及95可信区间范围为22.50mgkg(20.4424.76mgkg),（1）霍恩法（Horn）（2）改进寇氏法（3）Bliss法 最大似然性法（maximum likelihood method），最精确的计算方法,LD50的几种计算方法,三、急性毒性试验方法的要点,经典急性毒性试验：死亡急性毒性替代试验,固定剂量法,急性毒性分级法,上-下移动法（阶梯法）,限量试验,经典急性致死（LD50）试验设计流程,总体原则,经典急性毒性试验,实验动物染毒途径染毒剂量观察周期观察指标的选择、计算方法和评价,急性毒性反应与人近似 易于饲养、操作方便 繁殖力较强，数量较大 价格较低，易于获得,（一）实验动物的选择和要求,主要原则,除特殊需要外，首选哺乳动物,实验动物的物种和品系,啮齿类（rodent species）,非啮齿类（nonrodent species）,小鼠：昆明种、NIH、ICR,大鼠：Sprague-Dawley（SD）、Wistar,犬或猴,为了有利于预测化合物对人的危害，要求选择两种以上的实验动物，最好一种为啮齿类，一种为非啮齿类，分别求出其急性毒性参数。,根据接触途径选择实验动物,急性经口和吸入毒性试验大鼠、小鼠,急性经皮毒性试验成年大鼠、豚鼠、家兔,实验动物的物种和品系,实验动物的年龄和体重,刚成年、健康、未曾交配和受孕的动物小动物根据体重同一次试验相同性别实验动物起始体重变异范围不应超过平均体重的20%,实验动物的生存年限与体重选择,实验动物的性别,雌雄各半如雌、雄动物毒效应有明显差异，应分别并求出雌性和雄性动物的LD50值特殊的试验研究可仅作单一性别的急性毒性试验,实验动物分组与数量,根据组数和每组数量来决定总数量LD50，一般为4-6组大、小鼠每组每性别至少5只，犬类3只严格遵循随机、均衡的原则,随机性：每只动物分散到各组去的机会均等，以避免成见或系统误差均衡性：各组动物的平均体重及体重的离散度尽可能一致 每只动物的体重不应超过全体实验动物平均体重的20%每组之间的平均体重相差不应超过10%,控制离散度,控制均衡性,实验动物的预检,给药前检疫观察大、小鼠、兔、豚鼠1周，犬猴2-3周适应新环境，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响筛检健康状况不符合试验要求的动物,实验动物的给药前禁食处理,经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰 大、小鼠隔夜禁食，染毒2h后提供饲料 经口多次染毒可不禁食,（二）受试物及处理,理化特性水溶液、混悬液、油溶液水溶性受试物：蒸馏水、去离子水、生理盐水，保持与体内渗透压一致（注射）水不溶性受试物：溶于或悬浮于适当的有机溶剂中受试物一般应临用前新配,受试物成分和配方应稳定不变,适宜容积染毒,毒性较大的受试物给药量较小毒性较低的受试物常需较大量的染毒给药容积根据染毒途径和实验动物 经口：20ml/kg(空腹动物)经皮：2ml/kg 静脉：1ml/kg(5min以上),受试物及处理,(三)染毒方法,模拟实际接触的途径和方式受试物的性质和用途受试物毒性评价程序的要求有利于不同化学物之间结果的比较,工业毒物：经呼吸道、皮肤农用化学物：经口、皮肤、呼吸道药品：经口、注射、皮肤食品：经口环境污染物：经口、呼吸道、皮肤,染毒途径,染毒方法,消化道、呼吸道、皮肤、注射,染毒途径影响受试物急性毒性,染毒方法,不同途径的吸收量和吸收速率,吸收速率：静脉注射呼吸道肌肉注射腹腔注射皮下注射消化道皮内注射经皮同一受试物不同染毒途径LD50的大小通常符合上述规律,经口（胃肠道）染毒,LD50值来比较不同化学物急性毒性大小,灌胃：溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内，等容量灌胃法吞咽胶囊：将受试物装入胶囊中，放至舌后部，迫使动物咽下。犬、猴喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验动物自行摄入,染毒方法,空腹灌胃后23h复食灌胃的体积不超过体重的1%-2%小鼠0.2-1.0ml/只，0.1-0.5ml/10g 大鼠5ml/只，0.5-1.5ml/100g 家兔10ml/2kg，狗50ml/10kg,灌胃法,常用实验动物一次参考最大灌胃量,灌胃法,灌胃法是用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内。小鼠的灌胃针长约45cm，直径为1mm，大鼠的灌胃针长约68cm，直径约1.2mm。灌胃针的尖端焊有一小圆金属球，金属球为中空的。焊金属球的目的是防止针头刺入气管或损伤消化道。针头金属球端弯曲成20左右的角度，以适应口腔、食道的生理弯曲度走向,染毒方法,鼠类的灌胃法：用左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口腔插入，压迫鼠的头部，使口腔与食道成一直线,将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力,此时可略改变一下灌胃针方向，以刺激引起吞咽动作，顺势将药液注入。一般灌胃针插入小鼠深度为34cm，大鼠或豚鼠为46cm。,静式吸入染毒动式吸入染毒,经呼吸道染毒,气管内注入,染毒方法,吸入染毒,静式吸入染毒,染毒方法,方法：一定体积的密闭容器，加入易挥发的液态或气态受试物染毒柜体积、动物数、时间，依据实验动物最低需气量计算优点：简单、方便、受试物消耗少，适合于小鼠缺点：氧气减少，浓度不稳定，经皮吸收，不适合稍大动物，挥发性不强的受试物用此法受限,实验动物的最低需气量及不同染毒柜容积放置动物数（染毒2h）,动式吸入染毒,将实验动物处于有空气流动的染毒柜中，新鲜空气不断流入，污染空气不断流出。温度、湿度、氧及二氧化碳分压相对恒定，并有随时补充受试物，维持浓度稳定。可采样监测受试物浓度，可持续接触受试物，无时间限制,染毒方法,动式吸入染毒装置的组成,染毒柜机械通风系统配气系统,染毒方法,动式吸入染毒设备,A 整体暴露 B 口鼻暴露,动式吸入染毒优缺点,染毒方法,优点：受试物浓度和氧分压比较稳定缺点：设备要求高，消耗受试物量很大，操作比较复杂，费时费工,经皮肤染毒,染毒方法,农药、化妆品、工业、环境、外用药物常用大鼠染毒方式：,脱毛：化学或机械法脱毛（体表面积的10%）染毒：局部涂敷或大鼠、小鼠浸尾法,经注射途径染毒,染毒方法,注射药品、机制研究、毒物代谢动力学分类：,几种动物不同注射途径注射量(ml)范围,（四）剂量选择,参考新化学物的理化性质参考相关资料先用少量动物，以较大的剂量间隔染毒，找出10%-90%（或0%-100%）的致死剂量范围，然后设计正式实验的剂量和分组根据试验所选的LD50计算方法确定剂量组数,预试一般每组4只动物，每次3组，以10倍为组距。根据第一次预试结果判定需要增加还是降低剂量，组距保持不变，直至粗略预测到LD100及LD0为止。,各组剂量的计算,i=（lgLD90-lgLD10）/（n-1）,或 i=（lgLD100-lgLD0）/（n-1）,i为组距，n为设计的剂量组数。以最低剂量值（LD0或LD10）的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依次类推直至最高剂量组,剂量选择,剂量选择,化学物LD50大于2g/kg 或5g/kg，表明毒性不大我国药品的毒理研究指导原则规定要以最大容积最高浓度给予动物后未见死亡,不必计算LD50,全面观察动物的各种反应和变化，仔细分析实验动物在染毒后出现的中毒表现、剂量效应、时间分布。观察记录的内容：,中毒体征及发生过程 死亡情况和时间分布 体重 病理形态学变化,（五）毒性作用观察,毒性作用观察,中毒体征及发生过程,详细观察和记录动物出现的中毒体征 发生时间 体征发展的经过各个系统的特征初步确定急性毒性靶器官不同表现提供毒性机制的信息,续表6-1 啮齿类动物急性中毒表现,毒性作用观察,死亡情况和时间分布,实验动物的死亡数对LD50值产生明显影响分析中毒死亡时间的分布规律可以提供重要信息：原形，代谢,体重,毒性作用观察,反映动物中毒后综合性整体变化，比较客观简便的量化指标应定期多次称量动物的体重变化，一般为每周1次或2次对体重指标的变化要仔细观察和分析,体重变化的原因,毒性作用观察,影响食欲或消化系统的功能影响食物的吸收和利用影响水的摄取肾功能急性损伤,毒性作用观察,病理检查,死亡动物：大体病理变化，如脏器外观、大小、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其他改变存活动物：观察期结束时亦应进行解剖检查，必要时做组织病理学检查,（六）观察时间和周期,染毒以后应即刻开始观察动物中毒表现和死亡情况给药当天应连续或多次观察，以后可根据情况，每天2次或多次观察直至试验周期结束,观察周期一般为14天LD50(LC50)计算时以观察周期内各组动物的总死亡数为依据不同化学物质引起动物死亡的时间存在个体差异速杀型化学毒物仅计算24h的死亡率,观察时间和周期,急性毒性替代试验-固定剂量法,不以动物死亡作为观察终点利用预先选定或固定的一系列剂量染毒，通过观察化学物的毒性效应对该化学物进行毒性分级剂量：5、50、300mg/kg，最高限量2000mg/kg分级标准（欧共体）：高 毒：LD502000mg/kg平均用大鼠14.8只，经典方法平均用大鼠24.2只。,OECD组织验证：（11个国家的33个实验室比较固定法和经典法的结果）,毒性分级：比较了30种化合物，根据欧共体急性口服毒性分级标准，一致性80.2%毒性反应：毒性反应类型、出现和持续时间等方面未见明显差别所用动物数：经典发平均用大鼠24.2只，固定剂量法平均用大鼠14.8法,替代试验-急性毒性分级法,以死亡为终点的分阶段试验法，每阶段3只动物，平均经2-4阶段，根据死亡动物数，判断急性毒性。首选大鼠，从25、200、2000mg/kg体重3个固定剂量中选择一个剂量开始试验，根据结果判断：不需要进一步试验进行分级；下一阶段以相同剂量的另一种性别试验；下一阶段以较高或较低的剂量水平进行（从200mg/kg体重开始）。动物观察14天，染毒当天观察体征和死亡至少两次，之后每日观察一次。每周测体重，所有动物进行大体解剖，必要时进行组织病理学检查。,上下移动法（阶梯法）,以死亡为终点，也可用于观察不同的终点。根据初步资料确定第一只动物接受化学物的剂量，由第一只动物染毒后的反应决定第二只动物的接受剂量，如死亡则下一个剂量降低，如存活则下一个剂量增高。该方法需要选择一个比较合适的剂量范围，使得大部分动物的所接受的化学物剂量在真正的平均致死剂量左右。方法改进后，仅需要6-9只动物。,急性毒性试验求出LD50(LC50)值，通过LD50值进行急性毒性分级(acute toxicity classification)，评价毒物的急性毒性强弱，比较毒物的急性毒性大小,四、急性毒性分级和评价,急性毒性分级和评价,外源化学物急性毒性分级(WHO,2003）,GB15193.3-2003食品安全性毒理学评价程序和方法的急性毒性分级标准,农药急性毒性分级标准（GB1567农药登记毒理学试验方法）,大鼠、兔、豚鼠,大鼠,大鼠,急性毒性危害类别和急性毒性估计值（GHS）（WHO-全球化学品统一分类和标签制度）,LD50的局限性,LD50的值不能等同于急性毒性，死亡仅仅是评价急性毒性的许多观察终点之一。化学物单次大剂量急性中毒，动物多死于神经系统和心血管功能障碍，并不能很好地显示毒作用的特征和靶器官LD50值不稳定:OECD的80个实验室测定5种化学物LD50，差别可达2.44-8.38倍物种差异对LD50影响大：16种化学药品对人的致死剂量小于小鼠的1/10，甚至差别更大。不能期望使用动物急性毒性试验结果来拟定人的临床剂量,急性毒性试验程序,受试物资料的采集：化学结构式、理化性质、纯度等，或查阅文献，搜集与之相近的化学物毒性资料。实验室的要求：GLP。实验动物的选择原则，年龄和体重等。实验动物的分组的随机性与均衡性。受试物剂量的分组确定。选定染毒途径，符合人类实际接触情况。中毒表现的观察，相关参数的计算。毒性分析。,鉴定报告应包括如下内容,1.受试样品名称、理化性状、配制方法、所用浓度；2.实验动物的种属、品系和来源（注明合格证号和动物级别）;3.实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、动物实验室合格证号；4.所用染毒途径、染毒浓度和动物分组，每组所用动物性别、数量及体重范围；5.计算LD50/LC50的方法；6.染毒后动物中毒表现及出现时间和恢复情况、死亡时间、大体解剖所见；7.列表报告结果，计算的LD50/LC50及其95%可信区间；8.结论。,复习,毒理学实验设计的基本原则毒理学实验中常用对照组的意义实验动物选择的原则和注意事项LD50的概念及毒理学意义,第三节 局部毒性试验,(Local toxic effect)(Local irritant effect),机体暴露于化学物后，在其接触和暴露部分造成的局部毒性损伤、刺激（如眼刺激、皮肤刺激）和（或）变态反应等农药、化妆品、消毒剂的常规项目刺激性、腐蚀性、致敏性,家兔眼刺激性：眼球表面接触受试物后产生的可逆性 炎性变化眼腐蚀性：眼球表面接触受试物后产生的不可逆 性组织损伤,一、眼刺激试验,Draize眼刺激试验（标准方法）,9只家兔，每只兔的一只眼睛滴入0.1 ml受试物。其中3只在滴人后2秒钟用20 ml微温水冲洗；3只在4秒后冲洗；3只不作冲洗。于滴入后24 h、48 h和72 h、4d和7d，以肉眼或手提式裂隙灯检查眼的反应。记录结膜（发红、球结膜水肿和分泌物）、角膜（浑浊程度和范围）和虹膜（充血、肿胀、对光反应）的反应程度和持续时间按规定分级标准进行评分，计算染毒后前4d最高总积分平均值和刺激反应持续时间刺激强度分为4级，即无、轻、中、重。,眼各部位损伤评分表,积分AB5 最高积为80,角膜,虹膜,结膜,化学品毒性鉴定技术规范,眼刺激强度评价标准,化学品毒性鉴定技术规范,皮肤刺激：皮肤接触或涂抹受试物后产生的局部可逆性的炎症变化皮肤腐蚀：皮肤接触或涂抹受试物后产生的局部不可逆性组织损伤单次/多次；完整/破损家兔、豚鼠,二、皮肤刺激试验,下列3种情况可不考虑做皮肤刺激试验：根据结构与活性关系及理化特性推测可能有腐蚀性的物质（如pH2或pH11.5）；受试物有很强的经皮吸收毒性，经皮LD50200mg/kg；在急性经皮毒性试验中染毒剂量达2000 mg/kg时仍未产生皮肤刺激体征的物质。,皮肤刺激试验,试验前24 h将动物背部脊柱两侧毛剪掉（不可损伤表皮），去毛范围各约3cm3cm取受试物0.5ml（g）直接涂在皮肤上（无损伤皮肤或损伤皮肤），对侧作为对照。然后封包、固定，敷用时间为4-24 h（应防止动物添食及经呼吸道吸收）。试验结束后，用温水或无刺激性溶剂除去残留受试物于除去受试物后的1、24和48h观察涂抹部位皮肤反应，依据红斑 和水肿的情况进行皮肤刺激反应评分一只家兔背部脊柱两侧可各准备3个去毛区进行剂量-反应研究，或测试多种受试物物种差异：有学者用Draize试验测试了40种化学品成分，皮肤反应的敏感顺序：兔豚鼠人猪,OECD皮肤腐蚀性体外试验方法,分离的大鼠皮肤、重建的人体皮肤、人工膜模拟人体皮肤评价指南规定：经上述体外皮肤腐蚀性试验发现受试物具有皮肤腐蚀性作用，可不再进行动物皮肤刺激/腐蚀试验，并可根据体外结果进行危害分级,即过敏性接触性皮炎，是一种对化学物免疫介导的皮肤反应，人体这类反应的特点为瘙痒、红斑、水肿、丘疹、水疱、融合水疱等。其他物种动物的反应可有所不同，可能仅见皮肤红斑和水肿豚鼠豚鼠最大值试验：诱导接触（弗氏佐剂FCA+受试物）间隔10-14天激发接触局部淋巴结试验（local lymph node assay，LLNA）,三、皮肤变态反应试验,眼刺激：牛角膜浑浊和渗透性试验，受精鸡卵尿囊绒膜试验，血红蛋白变性试验、兔眼角膜上皮细胞毒性试验皮肤刺激：体外皮肤刺激试验、单层皮肤细胞培养试验、表皮组织培养模型、器官型人工培养模型皮肤致敏：树突状细胞、T细胞免疫识别,局部毒作用替代试验,眼刺激试验：家兔皮肤原发性刺激试验：家兔/豚鼠皮肤致敏实验：豚鼠，诱导接触和激发接触,农药、化妆品、消毒剂,Thank You!,