mRNA的出口因素GLE 1和肌醇hexakisphosphate规范翻译的不同阶段.doc

mRNA的出口因素GLE 1和肌醇hexakisphosphate规范翻译的不同阶段蒂莫西A.博尔格， 1人Andrew W. Folkmann ，伊丽莎白研究陈德良1 ，1和Susan R. Wente 1，*1 465 21大道南，纳什维尔范德比尔特大学医学中心， U型3209 MRBIII ，细胞和发育生物学，TN 37232-8240 ， USA*通讯作者： susan.wente vanderbilt.edu作者10.1016/j.cell.2008.06.027概要需要适当的基因表达信使RNA（mRNA）的出口和翻译。然而，功能这些连续的步骤之间的联系没有得到充分的定义。 Gle1是必不可少的，保守的表达出口的因素，其出口功能依赖小分子肌醇hexakisphosphate（IP6 ） 。在这里，我们表明，无论是Gle1IP6的都需要高效的翻译终止在酿酒酵母和交互Gle1终止的因素。此外， Gle1有一个保守的起始因子与物理协会显示eIF3 ， gle1突变体的遗传相互作用与eIF3突变nip1 - 1 。引人注目的是， gle1突变体在启动的缺陷，而株缺乏IP6不。我们建议Gle1职能，连同IP6和DEAD盒蛋白Dbp5来调节终止。然而， Gle1还独立调解萌生。因此，具有独特的优势Gle1协调mRNA的出口和翻译机制。这些结果直接影响模型Gle1在病理生理功能的扰动.引言寿命期间需要一系列分子事件真核细胞的信使核糖核酸（mRNA） ，包括转录，加工，出口，翻译和退化。完成所有基因的表达，这些步骤的基础和具体的质量预测控制机制来控制每个（摩尔，2005年）。迄今为止，已记录功能连接转录，核加工，出口（荻原野岛， 2007年） 。例如，招聘的mRNA出口因素加上适当的转录和剪接（科勒和伤害， 2007年） 。 mRNA的出口和翻译之间的联系也存在（ Culjkovic等，2006 ;总值等，2007 ;金等， 2003 ; Rosenwald等，1995 ） ;然而，分子机制不足明确界定。据推测，这种联系允许高效蜂窝同时多层次的基因表达调控。真核翻译是一个保守的机制四个主要阶段：起始，伸长率，终止和回收（审查，卡普和洛尔施， 2004年） 。启动，涉及翻译主管核糖体的装配表达，取决于刺激的真核起始因子（EIFS）核糖体的装载。其中之一， eIF3 ，有6至13亚基（酿酒酵母和人类中，分别）和按职能40S亚基上的刺激复合物的形成（形成43S preinitiation复杂） ，招收的mRNA ，并促进启动现场扫描（ Hinnebusch 2006年） 。有趣的是， eIF3也调节终止后核糖体的解离和回收（ Pisarev等，2007）。正确的翻译终止是同样基因表达的关键。主要是受终止释放因子（ eRFs ） 1和3（ Sup45和Sup35 ，分别在酵母） （卡普洛尔施， 2004年） 。终止密码子是公认的eRF1 /Sup45 ，刺激核糖体肽基转移酶活性释放完成的多肽。这项活动是增强eRF3 ，虽然eRF3也结合的poly（A ）结合蛋白（ PABP/Pab1 ） ，并有可能在核糖体回收的作用（星野等， 1999） 。然而，一个mRNA翻译之前，必须退出核通过核孔复合物（ NPC ） 。初步mRNA的出口步骤需要认识到主管出口mRNA -蛋白质复合物（ mRNP ）运输因素Mex67 （脊椎动物TAP/NXF1 ）（ Gruter等，1998 ;片平等，1999 ; Segref等。1997年）。后Mex67依赖目标是在全国人民代表大会，有几个其他因素是必要的适当的出口。 Gle1是必不可少的出口因子基因在酵母和人类细胞（墨菲Wente ， 1996年;沃特金斯等， 1998） 。 Gle1联营公司与在酵母和hCG1全国人大通过nucleoporin - 42 （ Nup42 ）和NUP155在人体细胞（ Kendirgi等，2005 ;墨菲和Wente ， 1996年Rayala等; ， 2004年） 。在与小Gle1刺激分子的肌醇hexakisphosphate （ IP6） ，RNA依赖的ATP酶活性的Dbp5 （城堡罗马等，2006 ; Weirich等，2006）。 Dbp5是一个必不可少的成员DEAD盒解旋酶家族，与细胞质全国人大绑定网站在酵母中是并列Gle1 - Nup42在Nup159复杂（霍奇等人， 1999年，施密特等人， 1999年。 Snay霍奇等， 1998）。 Gle1/IP6-activated Dbp5转换为一个Dbp5ADP状态触发mRNP重塑，取代蛋白质以促进出口的方向性（陈等， 2007） 。此前的研究表明出口之间的耦合转换机制。脊椎动物TAP/NXF1促进RNA的翻译窝藏病毒构交通元素（ CTE ） （ Jin等，2003） 。证据还表明，帽结合蛋白eIF4E的调节出口的一个子集细胞周期相关的mRNA （ Culjkovic等，2006 ; Rosenwald等， 1995） 。有趣的是，最近的一份报告揭示了一种新的（ Gross等人，2007年） Dbp5的功能，在翻译终止。因此，我们推测Gle1可能也有一个翻译的作用通过Dbp5激活。虽然丰富的核Gle1RIM ， Gle1还发现，在细胞质中（德尔Priore等。1996年，沃特金斯等，1998 ），支持存在Gle1 。池的翻译机器。Gle1细胞功能的划分是特别重要的报道在人类之间的基因突变的因果联系GLE1和人类运动神经元退化严重的形式（ Nousiainen等， 2008） 。在这里，我们显示， Gle1有遗传与转换因素和扮演的角色物理相互作用终止和启动。令人惊讶的是， IP6的生产只需要翻译终止。这表明，Gle1翻译中扮演了两个独立的角色，在终止通过Dbp5 IP6的依赖激活启动这是IP6的和Dbp5独立。这项工作揭示了广泛的mRNA的出口，翻译和分子之间的联系提供了一个关键基因表达的协同调控机制步骤。结果Gle1戏剧翻译中的作用为了调查是否Gle1翻译功能，我们采用酿酒酵母模型系统，并分析了面板在翻译的存在生长缺陷的突变株抑制剂放线菌酮和巴龙霉素（图1A） 。以前这些抑制剂已经用于识别突变体在不同的翻译方面的缺陷（格林伯格等，1998 ;总值等， 2007; Wakem和谢尔曼， 1990年）一般翻译扰动，并允许快速评估。两个gle1温度敏感突变株（ gle1 2和gle1 - 4）增长同样野生型对照菌株在23丰富的媒体。然而，在23 ，都显着降低放线菌酮和巴龙霉素的存在增长（图1A） 。作为对照，窝藏株野生型GLE1表达质粒被救出的放线菌酮敏感生长缺陷（图1B） 。更重要的是，窝藏突变株在其他基因mRNA的出口需要通过NPC的 rat7 - 1 （ nup159 ） ， nup42D没有增长的抑制下这些条件（图1A） 。值得注意的是， Nup159和Nup42全国人民代表大会分别Dbp5和Gle1 （ Hodge的对接网站等， 1999年，墨菲和Wente ， 1996年，施密特等人，1999 ） ，rat7 - 1突变体（ nup159 ）有严重的mRNA的出口缺陷（ Gorsch等， 1995） 。这表明，在过敏gle1突变体的翻译抑制不是归因于一般缺陷mRNA的出口。如果Gle1涉及翻译，我们推测，这可能是与核糖体相关联。蔗糖密度分馏与野生型菌株的裂解物和样品进行了分析Gle1免疫。多数Gle1被发现最轻（ nonribosome ）馏分;一个Gle1显著部分是在较重的核糖体分数，特别是上世纪80年代的一小部分（图1C ， 6车道） 。这表明功能， Gle1可能与核糖体相关联复合物。图1 。在翻译Gle1的作用（一）文化gle1 - 2 ， gle1 - 4 ， rat7 - 1 （ nup159 ） ， nup42D ， gfd1D ，与野生型（WT）的菌株，发现5倍系列稀释YPD单独或YPD含0.1 mg / ml的放线菌酮或0.4毫克/毫升巴龙霉素，然后孵育2天23（二） gle1 - 4的文化和野生型菌株转化空URA3 /岑质粒（ pURA3 ）或GLE1/URA3/CEN （ pGLE1 ）质粒遭受检举（一）市建局或无酮的选择性媒体。（三）在23生长的野生型菌株的裂解液蔗糖密度分馏immunoblotted与A - Gle1和A - Rps6 （核糖体控制蛋白质） 。核糖体分布测定OD254 。Gle1互动与终止因子Sup45接下来我们用遗传和生化实验，以测试是否Gle1起着翻译终止的作用。首先， gle1 sup45双突变株合成健身缺陷测试高温（图2A） 。在30 ，一个semipermissive gle1 - 4株，生长温度增长的gle1 4 sup45 - 2双突变体抑制相比，无论是单突变。其次，进行免疫共沉淀实验测试Gle1物理协会终止因素。使用Sup45和Sup35株抗原表位标签一个串联亲和纯化（TAP）的序列，我们孤立的复合物从细胞裂解物和immunoblotted （图2B ，顶面板）。大量的内源性Gle1水平分别coimmunoprecipitated Sup45的抽头。在隔离检测最小Gle1从控制裂解物缺乏自来水标签蛋白。 “Gle1 ： Sup45 ，抽头的相互作用是由核糖核酸酶治疗没有改变，表示，该协会是不通过介导RNA （数据未显示） 。虽然大大降低， Gle1也coimmunoprecipitated与Sup35 - TAP （图2B ，底部面板）。为了调查是否Gle1和Sup45直接绑定在体外，可溶性结合实验用细菌表达Gle1和GST标签Sup45 。相比一个控制仅与GST的测定，纯化的水平显着高于Gle1势必GST - Sup45 （图2C） 。此外， Gle1仍然会核糖核酸酶处理后的GST - Sup45 （数据未显示） 。 Dbp5也赞同Sup45 （ Gross等人，2007年） 。因此我们得出结论， Gle1 Dbp5都是物理连接翻译终止复杂。图2 。 GLE 1终止因素相互作用（一） 文化gle1 - 4 ， SUP 1-4， 45-2 ， GLE sup45 - 2 ，和野生型对照株（WT）的连续稀释， YPD发现，在23 或者30 孵育2-3天;（二） Immunoprecipitations SUP35 - TAP裂解物，SUP45抽头，和野生型（WT）的酵母菌株。裂解液（10 ）的输入和总immunblotted与A - Gle1或A -鼠IgG免疫（知识产权）检测的TAP标签蛋白（ ProtA ） 。（三） 可溶性结合实验与GST - Sup45或GST细菌裂解液和重组的纯化Gle1 。 Gle1输入（10）和约束样品immunoblotted与GST或A - Gle1 。Gle1都需要高效的翻译终止为了进一步研究Gle1在终端功能要求，我们进行了两个独立的检测终止效率。首先，我们用ADE2 - 1窝藏基因的菌株赭石义突变，呈红色，由于缺乏ADE2酶的功能。废话密码子通读，结果终止缺陷，产生功能ADE2蛋白并减少红色色素沉着（考克斯， 1965年） 。殖民地的一个野生型对照菌株红色，而temperaturesensitivesup45 - 2突变呈粉红色（图3A） 。与之形成鲜明对比的是，gle1 - 2 sup45 - 2和gle1 - 4 sup45 - 2双突变菌落是白色的。这表明在更严重的终止缺陷比各自单突变株的双突变。值得注意的是，这种效果是在允许的温度观察gle1突变体（ 23 ） 。我们还完成了一项实验，利用一个串联B -半乳糖苷酶/相隔很短的连接器序列的荧光素酶报告（斯塔尔等人， 1995年） 。三个相关质粒为基础的记者如图3B所示：一帧中插入一个终止密码子到连接区域（ TMV ） ，缺乏终止密码子的控制（TQ） ，以及从HIV - 1病毒的茎环已插入控制连接器（1789年） 。这些质粒转化控制和gle1突变株，并通读效率被确定在23到bgalactosidase荧光素酶的比例比较天晴控制和其他两个活动之间质粒产生的相对水平的异常终止通读。大致与先前的结果一致（斯塔尔等。1995年） ，野生型菌株显示， 27 读通过与TMV的构造（图3C） 。引人注目的是，在两个通读gle1 - 2和gle1 - 4株，大幅增加至71和73 。的影响，具体到正常终止，因为读通过的干循环的效率不会改变（图3C） 。与其他相似的结果终止密码子序列（数据未显示） 。一个rat7 - 1 （ nup159 ）应变显示最小变化（34） ，这表明，一般的扰动mRNA的出口没有影响翻译终止。另一种表达出口的突变株， nab2 - DN ，也没有明显的缺陷在通读效率（图S1A网上） 。缺陷也明显较少（36）在rat8 - 2 （ dbp5 ）在gle1突变体在23 ，和别人比突变以前报道在通读的温和增长（从16至25 ）rat8 - 2（ dbp5 ）突变后，在简短的脉冲的限制性温度（ Gross等人，2007年） 。我们的结论是，分歧反映突变的突变体之间的rat8 - 2 （ dbp5 ）和gle1特异性和突出gle1突变缺陷的鲁棒性。有趣的是， GLE1过度表达部分获救通读缺陷的一个sup35 - 21终止突变（图S1B ） 。两者合计，这些数据表明Gle1需要高效的翻译终止。接下来，我们分析功能直接后果终止。协会的Sup35与终止（ eRF3 ）复杂的是关键的一步，在终止和其他证明Dbp5是需要Sup35纳入到终止复合物（ Gross等人，2007年） 。蔗糖密度分馏控制裂解物和gle1 - 4株含有Sup35 TAP -标签（图3四）。在野生型样品，显著水平Sup35 cofractionated挖掘与核糖体（ 80S和多体，确定由OD254 ） 。光密度分析结果显示，约47 Sup35 ，抽头核糖体相关的野生型裂解物。然而，水平核糖体相关的Sup35点显着下降裂解液从gle1 - 4突变的细胞，尤其是在后来的多核糖，分数（比较gle1 - 4与野生型的车道7-12 ） ，和大多数的Sup35 - TAP转移到低密度分数（巷2 ） 。定量分析表明，核糖体水平相关gle1 - 4样品Sup35 TAP （26）下降近一半，在野生型。在gle1 - 4突变， Sup45Dbp5 ，和gle1G384R没有表现出核糖体显著下跌协会（图S1C ） 。我们得出的结论是Gle1促进核糖体协会在终止Sup35 。图3。 Gle1都需要高效的翻译终止（一）文化gle1 - 2 ， sup45 - 2 ， gle1 2 sup45 gle1 - 4 sup45 - 2 ，和野生型对照（WT）的连续稀释和0.25 YPD发现。板孵育被评定为4天，在23 ，和殖民地色彩。（二）串联b-galactosidase/luciferase记者构造表明：天晴（对照组）缺乏一个终止密码子在链接，烟草花叶病毒插入一个终止密码子帧到连接的地区， 1789插入从HIV - 1的茎环到连接器。（三） gle1 - 2 gle1 - 4， rat8 - 2 （ dbp5 ） ， rat7 - 1 （ nup159 ） ，与野生型对照（ WT ）株转化与串联记者构造，和荧光素酶和B -半乳糖苷酶检测。活动正常化细胞数，比率和荧光素酶B -半乳糖苷酶的活性进行了测定。通读活动是烟草花叶病毒的百分比或1789记者表示天晴控制每一株相比， N = 3A “ 5个独立的实验。误差棒代表扫描电镜的上方和下方的平均1 。 * P <0.01 。（四）裂解液SUP35 -抽头gle1 - 4 SUP35 -抽头株生长在23_C蔗糖密度分馏，用鼠标immunoblottedIgG的检测Sup35 ，抽头。核糖体分布测定OD254 ，和杂交，通过光密度分析分配核糖体协会百分比（ N = 4 ） 。扫描电镜的上方和下方的平均错误1 。 P <0.05。图4。 Gle1保守与eIF3亚基相互作用（一）表达hGle1 - GFP和eIF3f - HA的质粒共转染HeLa细胞，并immunoprecipitations A -绿色荧光蛋白抗体。与绿色荧光蛋白或细胞裂解液（ 5）和免疫immunoblotted一个“房委会” 。（二） Immunoprecipitations PRT1 - TAP裂解物， NIP1水龙头，野生型（WT）的酵母菌株。裂解液（10 ）的输入和总免疫（IP）的人immunoblotted与鼠IgG （塔标签蛋白质 ProtA ）或Gle1 。（三）重组纯化Gle1细菌裂解液孵育GSTPrt1Nip1 ， -Rpg1/Tif32 ， Tif34 ，或- Tif35 ，并结合蛋白进行分离A - Gle1免疫。对照组，裂解物孵育无Gle1 。核糖核酸酶A治疗与Gle1/GST-Prt1样品进行。总的约束，并输入（ 5）与A - GST或A - Gle1 immunoblotted 。（四）各自的gle1和nip1文化单，双突变株与野生型（WT）的连续稀释和YPD发现。板在23 ， 30或37孵育3天Gle1互动与启动因子eIF3虽然一致Dbp5相互作用，该协会Gle1与翻译终止复杂耐人寻味的在我们之前发现一个酵母双杂交之间的相互作用人类Gle1 （ hGle1 ）和F亚基（ P47 /S5 / 3的翻译起始因子eIF3 ） （ Rayala等，2004）。为了进一步研究这个人类细胞中的相互作用，我们转质粒表达绿色荧光蛋白标记hGle1和HA -标签eIF3fHeLa细胞。与抗GFP抗体的Immunoprecipitations总细胞裂解物（图4A） 。免疫印迹分析表明， eIF3f - HA是专门coisolated hGle1 - GFP 。这一结果证实hGle1与交互eIF3亚基。由于人类eIF3f亚基在酿酒酵母中是不守恒（ Hinnebusch 2006年） ，我们进行了immunoprecipitations从酵母菌株表达不同版本的TAP标签酵母eIF3亚基。内源性Gle1是coimmunoprecipitatedPRT1 - TAP （ eIF3b ） （图4B） 。我们没有始终如一与其他eIF3亚基检测Gle1显著coisolation测试（ Nip1/eIF3c ， Rpg1/eIF3a ，并Tif34/eIF3i ） ，虽然这可能反映了紧缩的实验条件（图4B和数据未显示） 。值得注意的是，我们没有检测到Dbp5中的PRT1自来水或Nip1 - TAP复合物（数据未所示）。我们的结论是Gle1身体联营公司eIF3亚基，并从这些相互作用是保守酵母到人类。为了测试Gle1和eIF3之间的直接物理相互作用，我们进行了体外结合实验。裂解液是由细菌每五个核心GST标签的融合表达酵母eIF3亚基（ PRT1 ， Nip1 ， Tif32/Rpg1 ， Tif34和Tif35 ）培养与重组纯化Gle1 。 Immunoprecipitations抗Gle1抗体，并GSTtagged eIF3亚基免疫印迹检测。至于如图4C所示， GST - PRT1 coisolated与Gle1 ，并核糖核酸酶处理后，该协会是维持。 GSTTif35 ，这是一个subcomplex PRT1 （潘等组成部分。2001年），也必将Gle1 。其他三个亚基没有专门绑定Gle1 。因此， Gle1物理与eIF3 ，与PRT1和Tif35两个潜在的具有约束力的表面。为了测试Gle1和eIF3之间的功能联系，我们产生gle1 nip1双突变株，并检测在不同的温度范围内生长。在23 ，无差异，观察单和双突变体之间的增长进行了比较（图4D ） 。然而，合成健身缺陷检测在30 ，其中gle1 - 2 nip1 - 1和gle1 - 4 nip1 - 1株有抑制细菌的生长的单突变体相比。相比之下，没有合成的生长缺陷，观察rat8 - 2（ dbp5 ） nip1 - 1或rat7 - 1 （ nup159 ） nip1 - 1双突变（图S2A数据未显示） 。互动的特殊性，进一步表明没有合成的生长缺陷，观察gle1 PRT1 - 1或gle1 rpg1 - 1双突变（数据未显示） 。因此，物理和遗传相互作用被发现Gle1和eIF3之间，以及这些功能似乎是独立的Dbp5 。Gle1在翻译起始的功能为了解决Gle1需要启动的假设，我们首先分析了monosome多核糖含量不同的突变株，用蔗糖密度沉淀。在允许的温度（ 23 ） ，从gle1 - 4突变的细胞的多核糖配置文件是从野生型细胞（图5A及5C ）类似。然而，后温度变化至37 ，显示gle1 - 4细胞显着升高monosome高峰期，减少了多体（图5D） 。此配置文件表示，在翻译起始的缺陷，因为它是类似的启动因素，包括nip1 （格林伯格等人， 1998年。 Nielsenet人，2004年）的有缺陷的菌株。有趣的是，在37的多核糖轮廓rat8 - 2 （ dbp5 ）也暗示启动缺陷（图S2B ） （ Gross等人， 2007年） 。作为对照，我们证实gle1 - 4缺陷GLE1表达质粒（图5G和5H ）救出。重要的是，在图5E ，应变缺乏GLE2 （ gle2D ）所示，另一种表达出口的因素（ Murphyet人， 1996年） 。编码，在monosome没有显著的扰动：在37 ，除了多核糖比例，显示一个nup116D应变与减少monosomes和多体（ Figure5F ）不同的配置文件。这可能是由于核糖体亚基出口减少在核质贩运37 nup116D细胞彗星的总块（舞台齐默尔曼等，2000年Wente和布洛贝尔， 1993年） 。因为gle1 - 4核糖体的姿态是有别于gle2D和nup116D概况，我们认为gle1 - 4缺陷的原因不是在mRNA的出口块。 “gle1 - 4突变的细胞改变配置文件支持Gle1翻译起始的作用。图5。包庇gle1等位基因突变的菌株多核糖简介缺陷多核糖型材所产生的细胞裂解液7 â “ 47 的蔗糖密度梯度离心和OD254分馏梯度分析。 （一） monosome （ 80S ）和多核糖峰标记。野生型细胞培养生长在23 （一）或转移到为75分钟（二）收获前37彗星。生长在23 （三）文化的gle1 - 4 ，或转移到37 （四）收获前75分钟的彗星。 mRNA的出口突变体gle2D （E）和nup116D （六）被转移到收获前75分钟37比特彗星。请注意， monosome和多核糖峰nup116D应变减少。 gle1 - 4和野生型（ WT）的控制株窝藏一个URA3/CEN或GLE1/URA3/CEN质粒转移到收获前60分钟（ GA “J ） 37彗星。图6。 GCN4激活缺陷检测gle1突变体野生型（WT）的， gle1 - 2 - 4 gle1 ， rat7 - 1 （ nup159 ） ，并rat8 - 2 （ dbp5 ）株转化与GCN4 - lacZ报告质粒。文化是生长在浦“ ，他的选择性培养基在23 2小时或30比特彗星。 3 aminotriazole （ 3AT ）增加。增长在23或30过夜后， B -半乳糖苷酶的活性进行检测。动表示为B -半乳糖苷酶的单位（ 1单位水解1毫摩尔的邻硝基酚- BD -半乳糖苷（ ONPG ）每分钟每单元基板） 。误差棒代表扫描电镜的上方和下方的平均1 。下表总结了每个在每个临时应变倍激活（ AT 3AT分为3 ） 。 * P < 0.05为在23与30倍的激活（ N = 3A “ 5个独立的实验） 。Gle1和eIF3之间的遗传和物理链路的基础上，我们测试gle1突变体是否有GCN4调控的缺陷。 GCN4表达，生物合成途径的活化剂，是受平移的控制（检讨，看到Hinnebusch 2005年） 。 GCN4 mRNA的翻译通常是derepressed氨基酸饥饿通过eIF2a磷酸化状态的改变。然而，这种调节是由受损，如起始因子eIF3 （例如， Nielsen等，2004年） ，并启动突变株的缺陷，往往表现出要么构镇压或derepression GCN4表达（ GCN或GCD的表型，分别） 。我们要研究GCN4表达，利用这50 GCN4地区的非编码链接到lacZ的记者。潜伏期3 aminotriazole （ 3AT ） ，组氨酸合成途径抑制剂，与野生型应变控制类似的程度上激活了在23或30 （图6） B -半乳糖苷酶的活性。相比之下，同时gle1 - 2和gle1 - 4株在3AT处理的样品在23的高活性在30 semipermissive的温度急剧减少的激活与这表明gle1突变体有一个GCN的表型，并在激活的急剧减少与翻译起始Gle1的作用是一致的。另一方面，在rat7 - 1株（ nup159 ） ，激活仍然在30观察，然而，到23相比小幅下降，在rat7 - 1 （ nup159 ）活动的基础水平株也下降， 3AT诱导倍，仅略有改变（图6） 。 rat7 - 1 （ nup159 ） 3AT激活突变体中也保持着高达34 （数据未显示） 。总体而言，与rat7 - 1 （ nup159 ）应变的结果在记者表达的出口缺陷完全一致。冷敏感突变株mRNA的出口， nab2 DN （ Marfatia等， 2003） ，也没有显示任何GCN4激活（图S2C公司）随温度变化的的变化。此外， sup45 - 2终止突变呈温和GCD表型与3AT （图S2D ）的情况下显著活动，表明gle1突变表型是由于终止缺陷。有趣的是， rat8 - 2 （ dbp5 ）突变株显示在一个semipermisssive温度（图6） ，在活动的大幅减少。这可能表明一个GCN缺陷;然而，类似rat7 - 1 （ nup159 ）突变，变化不大倍rat8 - 2 （ dbp5 ）突变。这些结果与缺乏的遗传和生化连接到翻译起始功能为Dbp5一致。我们得出结论，如果Dbp5次在启动的作用，这种作用是从Gle1不同。IP6的生产调节终止，但不启动在核出口， IP6的结合Gle1促进Dbp5共活化作用（城堡罗马等， 2006年。 Weirich等，2006 ）。 。 IP6的生成由磷脂酶C -依赖途径和两个肌醇激酶（纽约等， 1999）的协调活动。 Ipk2是一个双功能的转换肌醇1,4,5三磷酸肌醇激酶1,3,4,5,6 pentakisphosphate （ IP5 ） ，肌醇，而特定激酶， Ipk1 2介导的IP6的生产IP5 （纽约等， 1999） 。此外， IP6的激酶（ VIP1和Kcs1 ）负责生成不同的高阶pyrophosphorylated inositols （ Mulugu等人， 2007年; Saiardi等， 1999） 。在翻译这些可溶性inositides的角色没有以前的报告。我们发现， ipk1D应变翻译抑制剂放线菌酮（图7A）过敏。此外， ipk1D sup45 - 2双突变株的产生，并显示在所有具有杀伤力的温度在34 （图7B）合成生长缺陷。 ipk1D sup45 - 2株也呈上升终止读通过，升高ADE2 - 1株（数据未显示） ADE2生产检测的基础上。此外，像gle1突变株， ipk1D株站得高读通过串联记者吸附试验（图7C ）的活动（69） 。重要的是， ipk2D应变也增加了终止通读。相比之下，正常或仅轻度增高读通过活动观察vip1D和kcs1D株，分别。这些数据强烈牵连在翻译终止Ipk1 IP6的生产。因为IP6的直接结合Gle1 （城堡，罗马等，2006年。 Weirich等， 2006） ，我们假设IP6的可能也萌生了发挥作用。然而，从ipk1D应变裂解液中的多核糖剖面显示，在23或后转移到37 （图7D和数据未显示）没有重大的缺陷。相比之下gle1突变体， ipk1D应变也显示没有激活在任何温度测试（图7E ） GCN4 lacZ报告的扰动。最后，没有合成的遗传相互作用观察ipk1D nip1 - 1双突变（数据未显示） 。因此， Ipk1是不需要启动和启动功能的Gle1是不依赖于IP6的生产。讨论在这里，我们报告Gle1 ，一个善意的表达出口的因素，也有一个翻译的作用。引人注目的是， Gle1需要翻译起始和终止。终止，我们文件Gle1和Sup45/eRF1终止因子（图2） ，从gle1突变体（图3D）在Sup35/eRF3招聘扰动功能相关的遗传和物理之间的相互作用。我们进一步表明， Ipk1 ，特别IP6的生产，也与翻译终止。 Gle1和IP6平行Dbp5最近在翻译终止（ Gross等人，2007年）报道的这些要求。因此，我们预测，在终止Gle1/IP6作用是通过激活的Dbp5 。然而，我们也发现， Gle1影响翻译起始。有Gle1和亚基起始因子eIF3 （图4） ，以及在gle1突变体（图5和6 ）翻译起始缺陷之间的遗传和物理相互作用。与此形成鲜明对比的是， IP6的是不涉及在启动，任何Dbp5启动的作用是截然不同的Gle1 。有趣的是，这里使用的gle1突变等位基因温度敏感方面发起的缺陷，而终止的缺陷表现在允许的温度。因之进一步的建议， Gle1展品显着不同的功能在启动和终止。我们得出结论，在翻译的终止和启动Gle1的角色是分开Gle1启动功能，是独立的Dbp5和IP6的。我们进一步推测，在翻译Gle1和IP6的角色是其在mRNA出口的功能无关。具体来说，在gle1和ipk1突变体的翻译缺陷是由于间接的影响ofmRNAexport缺陷。有四个鲜明的证据支持这一结论的。第一，其他的mRNA出口突变株，如rat7 - 1 （ nup159 ） ，没有相同的表型（图1，3和6） （总值等， 2007） 。 gle1 - 2， gle1 - 4 ， rat7 - 1 （ nup159 ） ，和rat8 - 2株（ dbp5 ）有轻微表达出口的缺陷，更严重的缺陷，在23 37 （ Gorsch等，1995 ;墨菲和Wente ，1996年; Snay霍奇等人，1998年）。此外，这些突变体在相同的途径出口的mRNA （城堡，罗马等，2006 ;霍奇等人， 1999年） 。因为它们共享mRNA的出口类似的缺陷，不同的翻译表型很可能在不同的翻译功能缺陷的结果。我们的数据显示终止，但还没有启动缺陷在ipk1Dstrains支持gle1突变表型的特异性。第二，至少在某些检测， gle1和ipk1突变表型没有预期的结果mRNA的出口限制的突变。例如，在通读法（图3C和7C ） ，只表达出口的扰动应减少活动，或有没有影响（因为细胞质LAC - Z和荧光素酶报告的mRNA的水平减少出口将减少同样）。相反，在gle1和ipk1突变体，我们观察到在通读的急剧增加。第三，如果在重塑themRNPduring出口的缺陷是负责翻译的扰动，然后gle1 ， ipk1和dbp5突变体的表型应该是相同的。然而，它们是不同的，突出表现缺乏ipk1D突变启动缺陷。最后， Gle1是完全牵连在翻译通过其特定的物理作用在体内和体外（图2B，2C， 4A - 4C ）的翻译因素。 Gle1启动和终止因素的相互作用提供了一个直接连接两个转换步骤。往的研究表明，人类和酵母Gle1部分本地化的细胞质（德尔Priore等，1996; 。沃特金斯等人，1998年）和hGle1细胞核与细胞质之间的穿梭巴士（ Kendirgi等，2003 ）。这本地化额外Gle1在全国人民代表大会以外的其他网站的功能是一致的。此外， hGle1存在两种异构体， A和B ，除了在极端的羧基末端（ Kendirgi等， 2003）几乎相同。有趣的是，而hGle1B定位于核RIM ， hGle1A不，和它的主要功能可以在细胞质中。然而，由于替代酵母Gle1亚型尚未见报道，在酿酒酵母中的出口和翻译功能，大概是由相同的Gle1蛋白。图7。 IP6的调控终止，但不启动（一）被发现的5倍系列稀释YPD单独或YPD含0.1毫克/毫升放线菌酮ipk1D和野生型（WT）的菌株培养。板在23孵育2天（二） ipk1D sup45 - 2 - 2 sup45 ， ipk1D ，和野生型（WT）的菌株文化系列稀释， YPD发现，在23 ， 30 ， 34 C ， 37孵育2天（三）通读检测ipk1D ， ipk2D ， vip1D ， kcs1D ，和野生型（ WT）的控制株b-galactosidase/luciferase串联记者。被确定为图3C通读效率。 N = 4A “ 6个独立的实验。（四） ipk1D多核糖配置文件生成，如图5 。收获前75分钟到37彗星细胞转移。（五） GCN4活化分析与ipk1D野生型（ WT）的控制与GCN4 - lacZ报告，如图6株。误差棒代表扫描电镜的上方和下方的平均1 。我们建议， Gle1多个步骤来弥合夫妇mRNA的出口和翻译是一个关键因素。首先，作为mRNP通过核孔通过， RNA结合蛋白组成，是一种机制，需要Gle1/IP6 Dbp5 ATP酶（城堡，罗马等， 2006年激活改造;陈等，2007 ; Weirich等， 2006） 。这是可能Gle1结合在此期间全国易位步骤的mRNP ，整个翻译。然而，鉴于预测低的酵母Gle1细胞的丰度（ Ghaemmaghami等。 2003年） ，瞬态和/或监管的互动更容易。出口后， mRNA的翻译启动大会的外墙外保温系统和40S亚基。 Gle1和eIF3亚基（图4）之间的物理协会建议eIF3可以聘请Gle1起始复合物。精确的翻译起始Gle1生化作用是未知的。我们的研究结果表明，这Gle1依赖的启动步骤需要Dbp5和IP6 。 GCN gle1突变株（图6）的表型，可能表明Gle1在扫描和识别翻译起始站点的作用，虽然GCN4调控是复杂的，取决于许多流程（ Hinnebusch 2005年） 。确定在开展Gle1行动的机制是一个未来的目标.翻译终止阶段开始时，核糖体遇到一个终止密码子。 Krebber和他的同事提出Dbp5终止函数形成的mRNA与eRF1/Sup45复杂，然后重塑的mRNA -蛋白质复合体，让eRF3/Sup35招聘和终止复杂的正确定位（ Gross等人，2007年） 。因此，在终止Dbp5重塑功能是潜在的机制相似，其mRNA的出口（城堡，罗马等，2006年，陈等人， 2007年）。活动。这重塑机制是与我们的结果显示，在终止Gle1和IP6的运作都具有相互作用和/或高度相似Dbp5 （图1，2 ， 3和7 ）的突变缺陷完全一致。我们建议Gle1和IP6 coactivate Dbp5触发正确终止的翻译从事mRNP重塑。本重塑的效果可能会稳定eRF3/Sup35协会，游离在dbp5和gle1突变株（图3C） （建筑等， 2007） 。最后，虽然Dbp5可能从mRNP游离于终止的后期阶段（ Gross等人，2007年） ，一个令