《抗原与抗体》课件.ppt

第二部分 B细胞和T细胞应答的产生,B细胞和T细胞应答的产生,抗原和抗体补体系统主要组织相容性复合物和抗原递呈T细胞B细胞,第二章 抗原和抗体,抗原和抗体,抗原的基本知识抗体的基本知识免疫球蛋白基因的组成与表达抗原抗体相互作用,第一节 抗原的基本知识,抗原性与免疫原性,免疫原性(immunogenicity),诱导体液和/或细胞介导的免疫反应的能力。抗原性(antigenicity),与免疫反应最终产物(如抗体和/或T细胞表面受体)特异结合的能力。有免疫原性也有抗原性，但是反之并非这样。,抗原与半抗原,免疫原(immunogen),具有免疫原性半抗原(hapten),仅具有抗原性抗原/免疫原(antigen/immunogen,在同一动物机体内是同意词)，能够诱导机体免疫反应并与相应抗体或T细胞受体发生特异反应的物质。一个物质能否作为抗原，既取决于机体，也取决于抗原本身,免疫系统的抗原结合分子,抗体(免疫球蛋白，Ig)T细胞受体(TCR)主要组织相容性复合体(MHC),导致免疫原性的抗原特性,外源性分子大小 MW.5000-10000化学组成与复杂性 如异聚物比同聚物免疫原性更强抗原加工和递呈的敏感性 如不可溶的大分子通常是比可溶性小分子免疫原性更强（不可溶的大分子易于吞噬和加工）；不能被降解递呈的大分子物质免疫原性很低。,外源性(Foreignness),机体对“我/非我”(self/nonself)的识别导致免疫反应 我 耐受(在淋巴细胞发育期间未成熟淋巴细胞与自身成分相接触)非我 反应(抗原在这一关键时期没有与未成熟淋巴细胞相接触)免疫原与被免疫动物之间在系统发育上距离的远近，免疫原保守性的强弱，影响免疫原性的强弱。,导致免疫原性的生物系统,宿主的遗传组成 MHC，BCR和TCR等基因严重影响免疫原性抗原的免疫方式 免疫剂量、免疫途径与免疫次数佐剂的使用,佐剂(Adjuvants),定义：当与抗原混合一起注射能增强抗原免疫原性的物质。佐剂增强免疫原性的主要表现方式：1）延长抗原的存在 2）增强辅刺激信号 3）局部炎性增强(肉芽肿，granuloma，或其它炎性细胞反应)4）使被刺激的淋巴细胞非特异性增殖费氏佐剂(Freunds adjuvants)1)不完全佐剂(IFA):石蜡油、羊毛脂等，可减少抗原用量到1%，延长抗体合成期 2)完全佐剂(CFA):在IFA中加入结核菌或该菌细胞壁，其作用在于增强宿主细胞介导的免疫应答及抗体合成,常用佐剂基本作用方式,抗原表位(Epitopes),免疫细胞不识别或作用于完整的抗原分子，替代的淋巴细胞仅识别大分子中个别的位点，这些位点称为抗原表位(Epitopes)或抗原决定簇(Antigen determinants)淋巴细胞与复杂抗原的相互作用，可能发生在抗原结构的几个不同水平上。B、T淋巴细胞识别不同的抗原表位。,T细胞与B细胞抗原识别的比较,B细胞抗原表位的特性,天然蛋白的B细胞抗原表位通常由蛋白表面的亲水氨基酸组成，易于接近膜结合或自由的抗体。顺序抗原表位(Sequential Epitopes),连续抗原表位(Continuous Epitopes),蛋白质一级结构结构抗原表位(Continuous Epitopes),不连续抗原表位(Discontinuous Epitopes)，蛋白质三级结构,蛋白质结构与抗原表位,一级结构与顺序表位二级结构与抗原反应性三级结构与结构表位四级结构与结构表位、免疫原价数,半抗原的免疫特性,半抗原仅具有抗原性（反应原性，特异性）当与某种载体偶联后（半抗原载体结合物，hapten-carrier conjugate）能表现免疫原性半抗原载体结合物的特异性存在三类抗原决定 1）半抗原决定簇 2）未受影响的载体蛋白表位 3）半抗原和载体分子结合区形成的新表位,第二节 抗体的基本知识,抗体(Antibody),抗体，是与特定抗原发生特异性结合的蛋白质(免疫球蛋白,Ig)B细胞表面抗体识别免疫原，启动记忆B细胞和浆细胞的增殖和分化浆细胞分泌具有抗原特异性的可溶性抗体分子可溶性抗体分子与亲本B细胞表面受体具有相同的抗原识别性,抗体的基本结构与功能,共同的4肽链结构：两条相同的轻链(L,22,000 Da),两条相同的重链(H,55,000 Da)每条轻链和重链间通过二硫键和非共价键连接成异二聚体(H-L)，两个相同的H-L再结合成(H-L)2的抗体基本结构不同抗体间，轻链和重链最初的约110aa是改变很大的，称为可变(Variable,V)区；其余部分则相当保守，称为固定(Constant,C)区。重链上连有糖链。抗体的基本结构是与其功能（抗原结合；效应功能介导）相对应的,免疫球蛋白基本结构的发现,1940年前后，Tiselius Fc(fragment,crystallizable),150，000Da,50，000Da,45，000Da,100，000Da,50，000Da,22，000Da,多发性骨髓瘤与抗体氨基酸序列的研究,一个问题：-球蛋白中的抗体群是有许多不同抗体组成的，而aa序列分析需要纯蛋白正常个体的浆细胞，末期细胞，仅在有限的时间分泌抗体。多发性骨髓瘤（multiple myeloma）病人的骨髓瘤细胞（肿瘤浆细胞）能无限增殖，持续分泌特异性抗体。患者血清中95%的免疫球蛋白是这种骨髓瘤蛋白，其中许多病人的骨髓瘤细胞分泌超量的轻链蛋白。Bence-Jones首先在尿液中发现了这些超量的轻链蛋白，称为Bence-Jones蛋白。,Normal plasma cells help protect the body from germs and other harmful substances.,Myeloma cell(abnormal plasma cell)making M proteins.,轻链、重链分型与抗体分类,根据C区aa顺序（一级结构）轻链：(kappa)和(lambda)重链：(mu)、(gamma)、(alpha)、(delta)、(epsilon)依据重链分型不同Ig分为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE5类,免疫球蛋白的二级结构：反平行片层和环状结构(loops),免疫球蛋白的三级结构,免疫球蛋白的四级结构,可变区与抗原结合,不同特异性抗体可变区的氨基酸顺序比较显示，变异仅集中在其中一些独特的区域（占总氨基酸的15-20%），这些区域被称为超变区（hypervariable regions）;其余区域称为框架区（framework regions）超变区是抗原结合位，与抗原表位互补，又称为互补决定区（complement-determining regions，CDRs）。CDRs位于环状结构。,固定区与抗体生物活性,CL和CH1：有助于提高抗原结合，升高Fab臂最大旋转性，参与抗体多样性铰链区（IgA、IgD、IgG）,富含Pro和Cys，富有弹性，形成二硫键IgE、IgM的CH2区功能不确定IgA、IgD、IgG的CH2或IgE、IgM的CH3连接有糖基，因而亲水性较强，IgM、IgG通过此结构域激活补体，发生生物学效应。抗体Fc片段上两结构域共同与细胞膜Fc受体结合，发挥不同的生物学效应。,分泌免疫球蛋白(sIg)与膜结合免疫球蛋白(mIg),Secreted immunoglobulin（sIg）Membrane-bound immunoglobulin（mIg）sIg的重链羧末端结构域（IgA、IgD、IgG的CH3或IgE、IgM的CH4）在结构和功能上不同于mIg的相应结构域 sIg:亲水型aa组成 mIg包括三段不同序列：胞外亲水序列 疏水跨膜序列（26aa）胞质部分,B细胞不同发育阶段表达不同类型的Ig,B细胞不同发育阶段表达不同类型的Ig,但表达不同类型Ig的同一细胞，其抗原特异性一致。,免疫球蛋白种类与功能多样性,免疫球蛋白的抗原决定,同种型（Isotype）由C区决定同种异型（Allotype）由C区同一基因位置上不同等位基因的差异决定独特型（Idiotype）由可变区决定,Fc受体识别抗体Fc区,抗体B细胞Fc受体B细胞、T细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞,免疫球蛋白超家族,单克隆抗体,多克隆抗体：抗原多个表位诱导多种B细胞克隆增生与分化，产生多种抗体的混合物单克隆抗体：单个抗原表位诱导单种B细胞克隆增生与分化，产生单克隆抗体,单克隆抗体与细胞分化簇(CD),细胞分化簇(clusters of differentiation,CD)：白细胞表面的免疫功能分子，通过独特的单克隆抗体的识别，能够区分不同世系和阶段的免疫细胞CD1-CD350,第三节 免疫球蛋白基因的组成与表达,基因表达的中心法则,B细胞发育与免疫球蛋白基因表达,抗体的特征与其基因表达,与抗体特异性相应的巨大的抗体多样性Ig中存在着重链和轻链氨基端的可变区与羧基端的固定区具有相同抗原特异性的同型抗体，是具有既定的可变区和不同的重链固定区,抗体多样性的产生可变区基因的重排固定区基因的种类替换Ig基因的表达、合成、装配和分泌,解释抗体结构多样性的遗传理论,胚系理论（germ-line theories），认为胚胎细胞（卵和精子）基因组含有大量的Ig基因，不存在导致抗体多样性的特殊遗传理论。无法解释：当固定区不变时，产生可变区多样性的进化机制体细胞变异理论（somatic-variation theories），基因组包含有相对小数目的Ig基因，大量的抗体特异性产生于体细胞的变异或重组。无法解释：当产生可变区多样性时，保证固定区不变的机制,Dreyer&Bennett的双基因模式(Two-Gene Model，1965年),两个分开的基因编码一条Ig的重链或轻链，一个基因编码可变区，另一个编码固定区；这两个基因在DNA水平同步以保证转录和翻译为一条单独的重链或轻链；在胚系中，存在着成百上千的可变区基因，而仅需要存在一个单独的固定区基因。问题：当时没有直接的实验证据，而且与“一个基因编码一条多肽链”的生物学原则矛盾。,利根川进(Susnmu Tonegawa)理论：免疫球蛋白基因重排,1976年提出，1987年获诺奖 V区和C区基因呈分离状态，并在B细胞分化成熟过程中不断进行重排,目前的理论：免疫球蛋白基因的多基因组成,和轻链以及重链由位于不同染色体上分开的多基因家族编码。在胚系DNA中，每个多基因家族包含多个被非编码区分割的编码序列，称为基因片段（gene segments)。,重链,轻链,轻链,小鼠免疫球蛋白胚系基因片段的组成,基因可变区重排：轻链DNA的V-J重排,基因可变区重排：重链DNA的V-J重排,基因可变区重排的机制：重组信号序列引导重组,重组信号序列(recombin-ation signal sequences,RSS):位于基因片段侧翼(V的3；J的5；D的两侧)的小段DNA序列。功能:作为重排基因的重组加工信号。RSS组成:保守的回文结构七聚体+12或23bp的间隔序列+保守的富含AT的九聚体 One-turn RSS:含12bp间隔序列的;Two-turn RSS:含23bp间隔的序列。它们总是相互连接，因此称为one-turn/two-turn连接规则或12/23规则。,基因可变区重排的机制：重组酶连接基因片段,V(D)J重组酶:催化RSSs与编码序列间的连接反应(V-(D)-J重组)。RAG(recombination-activating genes)-1和RAG-2，仅在淋巴细胞特异表达。删除连接与翻转连接 具体的一些步骤：1)重组酶识别RSSs，两信号序列和邻近的编码序列靠近到一起 2)RAG-1和RAG-2在信号序列和编码序列结合处单链切割 3)RAG-1和RAG-2催化DNA的双链切割，同时在编码序列末端和信号序列双链切割的末端产生一个发夹结构,基因可变区重排的机制：重组酶连接基因片段,4）单链内切核酸酶随机切割发夹结构产生回文的P-区核苷酸加入；5）末端脱氧核酸转移酶(TdT)在重链 V,D,J编码序列的切割末端加上至15个核苷酸的N-区核苷酸；双链断裂修补酶（DSBR）修补和连接组合编码序列和信号序列，产生编码连接序列和信号连接序列,基因可变区重排的机制：连接弹性(连接多样性),连接弹性（junctional flexibility）,又称连接多样性（junctional diversity），即在V-(D)-J重排中，信号序列与编码序列的链接是精确的，而随后的编码序列间的连接是不精确的。连接弹性的结果导致了重排的多样性，也导致某些重排是没有结果的。,基因可变区重排的机制：等位基因排斥确保了单抗原特异性,等位基因排斥（allelic exclusion），在一个B细胞中，虽然B细胞是二倍体，但是仅表达来自一条染色体的重链重排基因或轻链重排基因。确保了功能B细胞从不表达多于一个的VHDHJH或VLJL 这一现象提示一旦一个VHDHJH或VLJL重排物产生，重组的机制就关闭了,等位基因排斥的模型，首先重链基因重排，一旦一个重链基因重排发生，其蛋白产物就阻止别的重链等位基因重排事件,而启动轻链基因重排。,抗体多样性的产生,多胚系基因片段：Multiple germ-line gene segments V-(D)-J连接组合：Combinatorial V-(D)-J joining 连接弹性：Junctional flexibility P-区核苷酸增加：P-region nucleotide addition(P-addition)N-区核苷酸增加：N-region nucleotide addition(N-addition)体细胞高突变：Somatic hypermutation 轻重链组合：Combinatorial association of light and heavy chains,多胚系基因片段与V-(D)-J连接组合,连接弹性:信号序列精确连接，编码序列连接不精确,P核苷酸增加和N-核苷酸增加中的随机性,B细胞发生随机的高频率体细胞突变,固定区基因间的种类转换(class switching),种类转换:B细胞抗原刺激后，重链DNA进行进一步的重排，VHDHJH 能与任何CH基因片段结合。这一过程称为种类转换或同型转换，其参与的DNA侧翼序列(转换区，switch regions)位于每个CH片段的上游。转换信号来自于细胞因子。,IL-4诱导的种类转换机制,Ig基因表达（mIg or sIg）,Ig基因表达(同时表达IgM和IgD）,免疫球蛋白的合成、装配和分泌,免疫球蛋白基因的转录调控,第四节 抗原-抗体相互作用,主要内容,抗原抗体反应的原理交叉反应(Cross Reactivity)沉淀反应和凝集反应抗原抗体反应的应用 放免测定、Elisa、Western Blot,抗原抗体反应的原理,抗原抗体之间的相互作用力：氢键 离子键 疏水作用力 范德华力,亲和力可以用来衡量抗原抗体的结合能力,抗原抗体反应的化学平衡,平衡常数,平衡常数又称为亲和力常数(affinity constant),解离常数,平衡透析法确定亲和力常数,抗体与单价抗原的作用,r：表示结合的抗原浓度与总抗体浓度的比率c：表示游离的抗原浓度n：表示抗体的价数,亲和力的测定,Polyclonal antibody,抗体与多价抗原的作用,亲合力（avidity）一个抗体与整个抗原的结合能力。亲合力大大强于每一位点的亲和力，其强度增加不仅仅是亲和力的简单相加，而是呈几何级数上升的。,交叉反应,交叉反应是指不同抗原分子上有相同或相似的抗原决定簇,一种抗体可以与两种或两种以上的抗原发生反应。,沉淀反应,可溶性抗原与抗体结合，在两者比例合适时，可形成较大的不溶性免疫复合物。在反应体系中出现不透明的沉淀物，这种抗原抗体反应称为沉淀反应(precipitation reaction)。,凝胶中的沉淀反应,电泳条件下的沉淀反应,凝集反应,颗粒性抗原(如细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒)与相应抗体结合，在一定条件下可形成凝集团块的现现象称为凝集反应(agglutination reaction)。,放射免疫测定(Radioimmunoassay,RIA),酶联免疫吸附测定(ELISA),Western Blotting,免疫沉淀(immunoprecipitates)磁珠分选,免疫荧光(immunofluorescence),荧光与流式细胞术(Flow Cytometry),免疫胶体金与电子显微镜,