分子生物学第035章DNA重组.ppt
3.5 DNA重组,一、DNA重组的定义和意义二、同源重组三、位点特异重组四、转座重组,一、DNA重组的定义和意义,DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组（genetic recombination），也叫DNA重组。DNA重组广泛存在于各类生物。真核生物基因组的遗传重组多发生在减数分裂时同源染色体之间的交换（Crossover）。细菌及噬菌体的基因组为单倍体，来自不同亲代的两组DNA之间可通过多种形式进行遗传重组。,DNA重组对生物进化起着关键的作用。生物进化是生物随时间发生变化和多样化的过程。生物进化以不断产生的可遗传变异为基础。然而，突变的机率很低，而且多数突变是有害的。如果生物只有突变没有重组，在积累优势突变的同时，不可避免地积累许多难以摆脱的不利突变，有利突变将和不利突变一起被淘汰，新的优良基因就可不能出现。重组的意义在于，它能够迅速增加群体的遗传多样性（diversity），通过优化组合积累有利的突变。,遗传重组的意义,遗传重组的意义,遗传重组系统的功能随它们的机制而变化，包括在特异DNA修复系统中的作用，在DNA复制中的特异活性，某些基因表达的调节，在真核细胞分裂期间促进染色体分离，维持遗传多样性，和在胚胎发育期间实现程序性遗传重排。,DNA重组的类型,DNA重组主要包括三种类型：同源重组（homologous recombination）位点特异重组（site-specific recombination）转座重组（transpositional recombination）,二、同源重组,同源重组也叫一般性重组（general recombination），它包括任何两个DNA分子（或同一个分子的两个片段）之间的遗传交换。发生交换的两个分子或同一分子的两个片段之间有一段近乎相同的序列（同源区），不论这个序列的具体碱基序列是什么，只要这两段DNA序列相似就可以发生。这两个同源区通过配对、链断裂和再连接，产生片段交换。,减数分裂中的同源重组,在减数分裂前期，参与联会的同源染色体实际上已复制成两条染色单体，从而出现由4条染色单体构成的四联体。在四联体的某些位置，非姊妹染色单体之间可以发生交换。,细菌中同源重组的意义,在细菌中，同源重组主要发生在DNA修复过程，本书中称为重组DNA修复。它通常是指对DNA损伤位点进行复制叉重建。在接合（交配）期间，当染色体DNA从供体细胞转移到受体细胞时，也能够发生同源重组。接合期间的重组虽然很少在野生型细菌中发生，但却产生了遗传多样性。,细菌中同源重组的意义,细菌可以通过多种途径进行细胞间基因转移，并通过基因重组以适应随时改变的环境。细菌的基因转移主要有四种机制：接合、转化、转导和细胞融合。F+细胞的 F 因子通过接合可将供体大肠杆菌的染色体转移到受体细胞中（转移的也可能是部分染色体），供体染色体DNA进入受体细胞后，可与受体染色体发生同源重组，增加受体细胞的遗传多样性。,Holliday模型,Robin Holliday于1964年提出一个解释同源重组的模型，在这个模型中，两个同源染色体DNA排列整齐；一个DNA的一条链断裂并与另一个DNA对应的链连接，形成连接分子，称为Holliday中间体；通过分支移动产生异源双链DNA；holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体。,Holliday模型,Holliday模型的缺点,Holliday模型能够较好地解释同源重组现象。但该模型认为进行重组的两个DNA分子在开始时需要的对应链的相同位置上发生断裂，这是很难设想的。现在认为，同源分子中的一个分子需要双链断裂才能启动与另一个分子之间发生重组。同源重组是减数分裂时同源染色体联会的原因，而不是结果。,DNA双链断裂启动同源重组,这个模型有四个关键特征。首先，同源染色体对齐。第二，一个DNA分子的双链断裂被核酸外切酶扩大，在断裂端产生3突出的单链（步骤1）。第三，暴露的3末端侵入完整的双链DNA，然后分支移动（branch migration）和复制产生一对交换结构，称为Holliday连结体（Holliday junctions）（步骤2到4）。第四，两个交换断裂产生两个完整的重组产物（步骤5）。,DNA双链断裂启动同源重组,DNA双链断裂启动同源重组,同源重组时的分支移动,Holliday中间体的电镜照片,A Holliday intermediate formed between two bacterial plasmids in vivo,as seen with the electron microscope.The intermediates are named for Robin Holliday,who first proposed their existence in 1964.,重组需要多种酶及其它蛋白质的作用,从原核生物和真核生物中已经分离出了促进同源重组各步骤的酶。在大肠杆菌中，recB、recC和recD基因编码RecBCD酶，它具有解旋酶和核酸酶两种活性。RecA蛋白促进同源重组所有的重要步骤：两个DNA配对，形成Holliday中间体，分支移动。RuvA和RuvB蛋白（修复UV损伤）形成一个复合物结合到Holliday中间体上，取代RecA蛋白，促进以比RecA更高的速度分支移动。特异裂解Holliday中间体的核酸酶（常称为解离酶）已经从细菌和酵母中分离出来了。RuvC蛋白是大肠杆菌中至少两种这样的核酸酶中的一种。,RecBCD酶的作用,RecBCD酶结合到线性DNA的断裂端，沿着双螺旋移动，解开并降解DNA，这是与ATP水解相偶联的反应。当它和一个称为chi的序列（GCTGGTGG）相互作用时，酶活性被改变。从这个点，具有3末端的链的降解逐渐减缓，但具有5末端的链的降解加速。这个过程产生了一段具有3末端的单链突出。,RecBCD酶的作用,Chi位点与重组频率的关系,在大肠杆菌基因组中散布的1009个chi序列使得chi位点1000bp范围内重组的频率增加了约5-10倍。随着离chi位点距离的增加，重组频率下降。在其它几种生物中也鉴别出了增加重组频率的序列。,RecA蛋白的作用,RecA结合到缺口处的DNA单链部分上，然后装配成的纤丝迅速覆盖到邻近的双链部分。RecF、RecO和RecR蛋白调节RecA纤丝的装配和拆卸。表示RecA纤丝重组活性的一个有用模型是体外DNA链交换反应。首先RecA结合到DNA的一条单链上，装配成核蛋白纤丝。RecA纤丝与同源双链DNA结合并对齐，然后在两个DNA分子之间发生链交换，产生杂合DNA。交换以6bp/s的速率进行，相对于RecA纤丝中的单链DNA以53的方向前进。这个反应能够涉及三或四条链。在涉及四条链时，就会形成Holliday中间体。,RecA蛋白与单链DNA组成核蛋白纤丝,右手螺旋每一圈含6个RecA蛋白，红色表示其中一个RecA蛋白单体。,RecA介导的DNA链交换模型,体外RecA促进的链交换反应,体外RecA促进的链交换反应,同源重组中其它酶的作用,一旦Holliday中间体形成，还需要一批宿主的酶（拓扑异构酶、RuvAB分支转移蛋白、解离酶、其它核酸酶、DNA聚合酶和及DNA连接酶）来完成重组。大肠杆菌的RuvC蛋白（Mr20,000）裂解Holliday中间体，产生全长的、不分支的染色体产物。,同源重组对同源序列的要求,DNA同源重组是一个十分精确的过程，哪怕只有一个核苷酸的差错都会导致基因失活。同源重组的分子基础是链间的碱基配对，通过碱基配对才能找到正确的位置，进行链的交换。实验表明，两DNA分子必须具有75bp以上的同源区才能发生同源重组，同源区小于此长度将显著降低重组率。同源区并不要求完全相同，少量的序列差异也可以进行同源重组。,三、位点特异重组,位点特异重组事实上发生在每一个细胞里，在不同的物种中作用差别非常大。作用包括调节某些基因表达和在胚胎发育中或在某些病毒和质粒的复制循环中促进程序性DNA重排。每一个位点特异重组系统由重组酶和一段短的、特异的DNA序列组成，这个特异序列是重组酶的作用位点（重组位点）。,位点特异重组的机制,重组酶识别和结合到两个不同DNA分子或同一个DNA分子的两个重组位点上。在每一个位点处一条DNA链在位点内的特异点断裂，重组酶在断裂位点通过磷酸酪氨酸（或磷酸丝氨酸）共价连接到DNA上。暂时的蛋白质DNA连接保护了DNA断裂的磷酸二酯键，使得在后续的步骤中不需要消耗高能辅因子如ATP。断裂的DNA链被重新连接到新的伴侣上，形成Holliday中间体，蛋白质DNA连接转变成新的磷酸二酯键。为了完成反应，过程必须在两个重组位点中的第二个点重复。,位点特异重组的机制,位点特异重组点的重组酶四聚体及与DNA结合的模型,另一种位点特异重组机制,在某些系统中，每一个重组位点的两条链被同时切开，然后重新连接到新的伴侣上，而不形成Holliday中间体。交换总是相互和精确的，反应完成后重新产生重组位点。重组酶既是位点特异的内切核酸酶又是连接酶。,位点特异重组的结果,噬菌体整合到大肠杆菌染色体上,体外研究的第一个位点特异重组系统是噬菌体编码的。当噬菌体DNA进入大肠杆菌细胞，一系列复杂的调节事件使得DNA进入两条途径之一。DNA要么复制，产生更多的噬菌体（进入裂解途径）；要么整合到宿主染色体上，随着染色体复制而传给子细胞（进入溶源化途径）。整合由噬菌体编码的重组酶（整合酶）催化，它作用于噬菌体和细菌DNA的重组位点，这些位点叫附着位点，分别是attP和attB。,噬菌体整合到大肠杆菌染色体的特异位点处,位点特异重组在DNA复制中的作用,环状的细菌染色体的重组DNA修复，有时产生有害的副产物。由核酸酶如RuvC在复制叉处裂解Holliday中间体，从而完成复制，可以产生两种产物：两个单体染色体，或连接的双体染色体。在共价连接染色体的情况下，细胞不能分裂成两个子细胞，正在分裂的细胞成为“棒状”。大肠杆菌中一种特殊的位点特异重组系统，XerCD系统，可以将双体染色体转变成单体染色体，细胞分裂得以进行。反应是位点特异的删除反应。,位点特异重组在DNA复制中的作用,Fork undergoing recombinational DNA repair,Tremination of replication,Resolution to monomers by XerCD system,2,Dimeric genome,细菌位点特异重组对基因表达的调控,鼠伤寒沙门氏杆菌由鞭毛蛋白决定的H抗原有两种，分别为H1鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋白。从单菌落的沙门氏菌中经常能出现少数呈另一H抗原的细菌细胞，这种现象称为鞭毛相转变。遗传分析表明，这种抗原相转变是由一段995bp的DNA（H片段）发生倒位导致的。H片段的两端为14bp的特异重组位点hix，其方向相反，发生重组后可使H片段倒位。H片段上有两个启动子（P），一个启动hin基因表达，另一个当取向与H2及rH1基因一致时可启动这两个基因表达。,细菌位点特异重组对基因表达的调控,rH1基因的表达产物是H1基因的阻遏蛋白，当H2和rH1基因表达时，H1基因不表达。当发生位点特异重组后，H片段倒位，由于启动子方向发生改变，H2和rH1基因不表达，H1基因阻遏，可以表达。H片段中的hin基因编码的是位点特异重组酶（倒位酶）。,H1 鞭毛蛋白,H2 鞭毛蛋白 阻遏蛋白,
