分子生物学第四次.ppt
,DNA复制的特点：1.DNA 半保留复制2.半不连续复制3.需要引物4.多为双向等速复制5.有一定的复制起始点6.DNA复制的保真性,2.DNA复制的几种方式(1).线性DNA复制的方式多数为双向复制，多个起始位点，复制叉处有眼状结构，称为复制眼。,线性DNA复制子末端复制,1.转变为环状或多聚分子2.在DNA末端形成发夹式结构3.在某种蛋白的介入下，在真正的末端复制4.真核生物线性染色体由端粒酶负责新合成链5端RNA引物切除后的填补,端粒酶是含RNA的逆转录酶,端粒酶与细胞老化有关,端粒（telomeres）：是真核细胞染色体末端所特有的结构，有许多串（1000串或更多）短的重复序列组成，通常3末端链是富含G的短序列。,端粒酶:含有RNA和蛋白质（起DNA聚合酶的作用）两种组分，RNA分子约150b，含有与重复端粒结构互补的一个片断，可作为端粒链合成的模板。,(2).环状DNA复制方式A.复制,B.滚环复制也叫复制,C.置换式（Displacement form）又称 D 环复制 两条链的合成高度不对称,一条链迅速合成出互补链,另一条则形成游离的单链环(D-环)线粒体和叶绿体 DNA的复制方式,DNA 复制的调控,原核生物的调控，DNA链的延伸速度恒定，复制叉的数量决定细胞生长和增值速度。ColEI 质粒DNA 的复制调控,DNA编码两个负调控因子，Rop 蛋白和反义RNA,RnaseH,真核细胞DNA 的复制调控,真核细胞的生活周期分为4个时期G1复制预备期、S复制期、G2有丝分裂准备期、M有丝分裂期,真核生物复制有3个水平的调控细胞生活周期水平调控，决定细胞停留在G1期还是进入S期染色体水平，决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序起始复制复制子水平调控，决定复制的起始与否,聚合酶链式反应PCR,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术典型的PCR由（1）高温变性（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93-94）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72将单核苷酸从引物的3端开始掺入，以目的基因为模板从53方向延伸 PCR能在（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建。,课后复习题：DNA半保留复制DNA 的半不连续复制复制子复制叉如果细菌环状染色体的复制是双向的，并且从固定的复制起点开始，每个复制叉以16um/min的速度移动，细菌染色体长1280um,完成整个染色体复制需要多少时间？当细菌在营养丰富的培养基每20min 分裂一次，也就是说第一轮复制尚未完成就开始第二轮复制，此时染色体有几个复制叉？,DNA损伤的后果,五、DNA 的修复,大肠杆菌中DNA的修复系统,1.错配修复,大肠杆菌DNA 甲基化位点新合成的DNA,Mis-paired bases,错配修复,2.直接修复,紫外线可引起DNA的交联,DNA与蛋白质的交联。,DNA紫外线损伤的光复合酶直接修复,3.碱基切除修复,指切除和替换由内源性化学物作用产生 的DNA碱基损伤,是切除修复的一种。受损碱基移除是由多个酶来完成的。主要针对DNA单链断裂和小的碱基改变 及氧化性损伤。,缺失碱基位点,DNA糖苷水解酶,Base Excision Repair,4.核苷酸切除修复,体内识别 DNA 损伤最多的修复通路,主要修复扭曲双螺旋结构的 DNA 损伤,修复时切除含有损伤碱基的那一段 DNA。,核苷酸切除修复(基因组修复人),5.DNA的重组修复,是复制后的修复DNA链的损伤并未除去一直只存在母链上！若干代后相当于被稀释。,胸腺嘧啶二聚体,6.SOS修复,为DNA的损伤所诱导，而产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高的突变率（所以会有2种结果：修复或变异（进化），这属于倾向差错的修复。,1、反向重复序列与二级结构 反向重复序列（inverted repeatitive sequence or inverted repeats IR）又称回文序列（廻文）：指两段同样的核苷酸序列同时存在于一个分子中，但具有相反的方向.有时也有不完全相同的情况 RNA和DNA中都可能存在 此外还可有directed repeatitive sequence-正向重复序列,一些DNA序列的不寻常结构,C,反向重复序列间间隔较短或无间隔,反向重复序列间间隔较长,*较短的回文序列可能是作为一种信号 如：限制性内切酶的识别位点 一些调控蛋白的识别位点,例如限制性内切酶 EcoR的识别位点 5GAATTC3 3CTTAAG5,六、转 座,基因组是相对稳定的，基因组中的序列通常处于恒定的位置。因此，我们可以通过构建遗传图谱(genetic map)来鉴定已知基因的基因座。在分子水平上，每个个体基因组之间的差异主要由重组引起，但转座元件（transposable element）或转座子（transposons）的存在也可以造成基因组的改变。,1.转座子的概念及发现,转座子(transposon 或 transposable element)是基因组内相对独立的、可移动序列，它们不必借用噬菌体或质粒的形式就可以从基因组的一个部位直接转移到另一个部位，这个过程称为转座（transposition）转座子每次移动时携带着转座必需的基因一起在基因组内跃迁，所以转座子又称跳跃基因（jumping gene）,转座元件首先是由Barbara McClintock于40年代在玉米的遗传学研究中发现的，她称之为控制元件（controlling element），因为它不仅能够在基因组内转移，而且还能够改变基因的活性并引起功能的改变。现在认为转座子存在于地球上所有的生物。,2 特点：转座子是基因组的正常组成成分，不以独立的形式存在（如噬菌体或质粒DNA）。不必借助同源序列就可移动的DNA片段，即转座作 用与供体和受体之间的序列无关。原核生物和真核生物均有转座子。转座序列可沿染色体移动，甚至在不同染色体间跳 跃。转座以很低的频率发生，而且转座子的插入是随机的，,3 种类与特征,（1）两种类型：A 简单转座子（simple transposon）或（插入序列 insertion sequence IS）B 复合转座子（composite transposon）,（2）特征：a）两端有2040bp的反向重复序列(IR)b）具有编码转座酶（transposase）的基因 c）复合转座子除转座酶基因外还有1数个基因。d）转座酶催化转座子插入新位点。,A 插入序列,最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分，是一个自主的单位，每种IS均编码自身转座所需的蛋白质。,命名：IS编号（鉴定类型）长度 7002000bp,每种IS元件具有不同序列，但有共同的组织形式,插入序列IS1的结构,B 复合转座子 表示法：通常以Tn和后面加上数码表示，如Tn903。结构:a.除有转座酶基因外还有其它表型基因，如：抗药基因，使宿主具表性效应。b.两侧有重复序列。c.有的转座子的重复顺序就是IS。功能：和 IS 一样可以从一个位点转座到另一个位点。,复合转座子结构示意图,IS1,IS1,a)TnA family,l 具有IR、转座酶基因、调节基因（解离酶）、抗抗生素基因,两种类型,b）两端重复序列为IS的复合转座子,e.g.IS插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子,其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。,当两个IS组件相同时，其中任一个都可行使转座功能,不同时，主要依靠一个,两侧的IS既可以是IR，又可以是DR状态（IR多）,4.转座发生的机制,转座子插入到一个新的部位的通常步骤是：在靶DNA上制造一个交错的切口，然后转座子与突出的单链末端相连接，并填充切口。交错末端的产生和填充解释了在插入部位产生靶DNA正向重复的原因。链的切口之间的交错决定了正向重复的长度。,1）复制型转座模式（replicative transposition）,转座子作为可移动的元件被复制，一个拷贝保留在供体原来的部位不变；另一个拷贝则插入到受体的位点上，结果供体和受体都有一个转座子的拷贝。需两种酶：转座酶(transposase)：作用于靶位点和原来转座子两端。解离酶(resolvase)：作用于复制后的拷贝。,复制型转座,复制型转座,3）非复制型转座（nonreplicative transposition)转座子从供体一个位点转移到受体新位点处，供体位点留下缺口，受到损伤（严重时致死）或宿主修复系统识别修复。只需转座酶,转座元件作为一个物理实体直接由一个部位转移到另一个部位。,除了引起在新部位序列插入的简单分子间转座之外，转座子还能促进其他类型的DNA重排。任何一对正向重复序列之间的重组会导致它们的序列的缺失；而一对反向重复序列之间的交互重组可能使重复序列之间的序列被倒位，而重复序列本身被保留。,玉米中的控制因子包括：自主型因子，具有自主剪接和转座的功能 非自主性因子，单独存在时很稳定，只当基因 组中存在与非自主性因子同家族的自主性因子时 才具备转座功能。同一家族的自主性因子能为非 自主性因子提供转座酶。,玉米中转座子的特点,玉米转座子具有典型的IS特征，转座子两翼有两个倒转重复序列，在靶DNA插入位点有两个短的正向重复序列。,在Ac-Ds体系中：Ac转座子的两翼有11bp的倒转重复序列，在靶DNA位点复制形成8bp正向重复 Ds 是Ac 转座子的缺失体，但两端转座序 列特征完整，如果细胞内有相应的转座酶 活性Ds 就能恢复转座性能,玉米转座因子对胚乳颜色的影响,果蝇中的转座子,诱发果蝇不育的P转座子，几乎所有的杂种不育都由P转座子插入基因组W位点引起的P:两翼有31bp倒置重复，靶DNA产生8bp的重复序列P转座子产生原初转录产物约为2.5或3.0kb,转座的遗传效应,转座引起插入突变转座可以产生新的基因转座产生染色体积畸变转座引起生物进化,反转录转座子(retrotransposon或retroposon),指通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件。这样的转座过程称为反转座作用(retrotransposition)。,反转座作用出现在真核生物，包括能自由地感染宿主细胞的反转录病毒，以及通过以RNA为中介进行转座的DNA序列。除反转录病毒外，反转录转座子可以分成两类：一类是病毒超家族(viral superfamily)，这类反转录转座子编码反转录酶或整合酶(integrases)，能自主地进行转录，其转座的机制同反转录病毒相似，但不能像反转录病毒那样以独立感染的方式进行传播 长末端重复序列(1ong terminal repeats，LTR)；另一类是非病毒超家族(nonviral superfamily)，自身没有转座酶或整合酶的编码能力，而在细胞内已有的酶系统作用下进行转座。,课后复习题：1.简述转座的机理？2.DNA修复的类型与机理？,
