《抗体制药》课件.ppt
第五章 抗体工程制药,抗体药物的生产,传统的方法抗血清淋巴细胞的培养如何获得需要的淋巴细胞？如何体外培养淋巴细胞？,1997年全球抗体药物销售额为3.1亿美元，同期全球药品销售额为3028亿美元，市场份额为千分之一到2008年，增长至400亿美元，同期全部药品销售7730亿美元，市场份额提升至5.2%抗体药物年销售额复合增速高达56%，是总药品销售增速的6倍,2009年，美国FDA批准的6项新的生物制品许可申请中，有4只产品属于单抗药物,欧洲7个,2010年,强生的抗肿瘤坏死因子(TNF)-单克隆抗体Remicade销量达74亿美元罗氏的Rituxan销售额达到65亿美元罗氏的抗Her-2受体单克隆抗体赫赛汀（Herceptin）销售额达到51亿美元,第一节 抗体药物概念及其特点,一、抗体药物概念,通过细胞工程或基因工程生产的，用于诊断或治疗的单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、基因工程改造的抗体或免疫偶联物统称为抗体药物,免疫偶联物,生物导弹是免疫导向药物的形象称呼由单克隆抗体与药物、酶、毒素或放射性同位素等配合而成,二、抗体药物特点,1.特异性1）与相关抗原的特异性结合2）对靶细胞的选择性2.多样性1）抗原多样性2）结构多样性3）抗体活性的多样性4）免疫偶联物和融合蛋白的多样性,第二节 杂交瘤技术与单克隆抗体,1975年，德国学者Kohler和英国学者Milstein合作研究将经绵羊红细胞免疫后的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，建立了能持续分泌抗棉样细胞抗体的杂交瘤细胞，从而创立了具有划时代意义的新技术，为此获得了1984年医学诺贝尔奖,一、抗体的种类,1.多克隆抗体多克隆抗体含有两层意思：一是有含多个抗原位区的大分子刺激产生的、识别不同抗原位区的各种抗体；二是由体内不同淋巴细胞产生的、可针对同一抗原位区的多克隆抗体 2.单克隆抗体仅识别抗原分子上同一抗原位区的由同一克隆细胞产生的抗体为单克隆抗体,传统抗血清,抗 原,免 疫,所有抗体混合,1,2,3,4,脾 脏,淋巴結,B 細胞,二、杂交瘤及杂交瘤技术,细胞杂交的含义包括同一细胞的自融合或是在诱导物的作用下不同细胞间的融合淋巴细胞通过融合剂的作用和肿瘤细胞形成融合的杂交细胞称杂交瘤细胞通过肿瘤细胞和淋巴细胞的融合，用于某些细胞特性的研究和生产所期望的免疫分子，称为杂交瘤技术,目前杂交瘤技术在免疫学领域的应用有两种B淋巴细胞杂交瘤，即用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞进行融合而制备抗体，也是引用最广泛的一种T细胞杂交瘤技术，肿瘤细胞和T细胞融合而制备具有免疫活性的淋巴因子 通常人们所述的杂交瘤技术即知B淋巴细胞杂交瘤，也可称为单克隆抗体技术,三、单克隆抗体,单克隆抗体是由一个骨髓瘤细胞和一个具有分泌抗体能力的B淋巴细胞融合形成的杂交瘤细胞，通过无性繁殖形成的细胞系而获得的这个细胞系的每个细胞均具有相同的特性且高度均一，这一细胞系分泌的抗体均一性极高，活性、亚基、亲合力均相同,单克隆抗体的特点,抗体结构高度均一。抗体分子在结构上高度均一，甚至在氨基酸的序列和空间结构上都相同 高度特异性。抗体识别的是抗原分子上单一的抗原位区稳定的生产特性。产生抗体的细胞是可以无性繁殖的细胞系,第三节 杂交瘤细胞系的建立,一、免疫B淋巴细胞的制备,1.抗原凡是能具有抗原性质的物质均可制备单克隆抗体，抗原可以是全病毒、亚单位或纯化分子，也可以是蛋白质、多糖、脂类等 用于制备单克隆抗体的抗原在理论上讲，纯度要求就可以不高，也可以使混合抗原,2.免疫,动物的选择 目前常用的骨髓瘤细胞系来自BALB/c小鼠和Lou大鼠免疫方法A.体内免疫法B.脾内免疫法C.体外免疫法,二、骨髓瘤细胞的选择,在B淋巴细胞杂交瘤技术中，主要是用多发性骨髓瘤细胞作为亲本细胞，这种细胞是来自骨髓造血细胞的一种肿瘤，分泌单一抗体的浆细胞，并且衰变成不表达自身抗体或部分表达常见的骨髓瘤亲本细胞系有Sp2/0，NS-1，Y3，YB2,三、免疫脾细胞的制备,经免疫的BABL/c小鼠或Lou大鼠，摘眼球、断颈等方法处死后，无菌摘取脾脏，研磨制取B淋巴细胞悬液，经氯化铵破碎红细胞后，洗涤并调整到（15）X107个ml浓度备用,四、细胞融合,将免疫脾B淋巴细胞和骨髓瘤细胞按照（510）：1混合后离心取上清，缓慢加入分子量在40006000的50PEG 1ml，间隔1分钟后，缓慢加入无血清培养基，终止融合剂的作用，经洗涤去除融合剂后加入细胞培养液，分种于96孔板中,五、特异杂交瘤细胞的选择,1.杂交瘤细胞的选择 融合后，有杂交瘤细胞有骨髓瘤B淋巴细胞、B淋巴瘤细胞B淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞，还有未融合的骨髓瘤细胞和B淋巴细胞一般用HAT培养液进行筛选,m,核酸补救合成,m,核酸从头合成,核酸,氨甲喋呤(A),(-),次黄嘌呤(H)胸苷(T),TK,HGPRT,TK-,HGPRT-,磷酸核糖转移酶,2.特异性抗体的筛选,筛选出的杂交瘤细胞并不是都能分泌所期望的抗体，所以还要对杂交瘤细胞做的二次筛选，即对所分泌的抗体进行检测 一般地，细胞培养的上清液中，抗体可以达到每毫升微克级的水平，目前检测方法的灵敏度都可以达到。实验室常用的是酶联免疫的方法，即ELISA方法,六、杂交瘤细胞的克隆和建株,1.杂交瘤细胞的克隆化 2.杂交瘤细胞系建株,七、单克隆抗体的制备,1.动物体内诱生法 2.体外培养法,八、单克隆抗体生产的一般流程,体外培养的骨髓瘤细胞 免疫纯系小鼠，取脾脏细胞 体外融合 HAT选择培养 抗体检测，阳性孔 克隆化培养，抗体检测 阳性克隆扩大培养 冻存细胞，建立细胞库 体外法制备单克隆抗体 体内法制备单克隆抗体腹水 抗体检测,第四节 基因工程抗体,鼠单抗对人而言有较强得免疫原性，可以产生较强的人抗鼠抗体（HAMA）反应生产成本比较高，难以大规模普及应用,基因工程抗体优点,降低抗体的免疫原性。通过基因工程改造技术，可以最大程度地降低抗体的鼠源性，降低甚至是消除人体对抗体的排斥反应 穿透力强。基因工程抗体分子一般比较小，更容易到达病灶的核心部位 可以根据需要，制备多用途的新型抗体 成本降低。可采用原核细胞、低等真核细胞和植物等多种系统表达,一、人鼠嵌合抗体,在基因水平上将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来并在合适的宿主细胞中表达，这种抗体称为人鼠嵌合抗体,二、鼠单抗可变区人源化抗体,1.改行(型)抗体 将鼠单抗的CDR区移植到人单抗的骨架区，就可能使人单抗获得同鼠一样的抗体特异性，并可以最大限度地降低鼠单抗的异源性，这样就得到了改行抗体。这种改造过的抗体也称CDR移植抗体,2.表面氨基酸残基的人源化镶面抗体 将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中改成人源的，就成为了镶面抗体 3.表位印迹选择 表位印迹选择是一种与高效筛选噬菌体抗体库技术相结合的人源化抗体的方法，可以通过数轮筛选得到完全人源的抗体,三、小分子抗体,小分子抗体是完整免疫球蛋白的一部分，分子量比较小。1）Fab片段和重组Fab。Fab片段包括重链Fd段（可变区和第一恒定区）和完整的轻链，如果恒定区片段是人源的，即称为重组Fab。2）Fv和单链抗体（scFv），Fv是重链可变区和轻链可变区通过非共价键结合在一起，是抗体中完整活性的最小功能片段。ScFv是在两个可变区间用连接肽连接起来成为一条链。双价分子、单域抗体、最小识别单位等。,Fv,ScFv,单区抗体,最小识别单位,Fab,
