《微生物制药》课件.ppt

现代微生物发酵及技术教程,4.微生物发酵工程概述,2,4.微生物发酵工程概述,3,发酵工程是利用微生物细胞的代谢过程生产有用的各种产物的过程，它由三个核心部分组成：一、生产特定产物的微生物菌种的选育；二、利用适当的设备和技术为菌种提供最佳条件，充分发挥菌种的生产能力；三、将发酵产生的产物经分离、纯化，以提高收率获得质量合格的产品。微生物发酵工业以发酵为主，发酵水平的好坏是整个生产的关键，但后处理在发酵生产中也占有重要的地位。完整的微生物发酵工程应该包括从原料到获得终产品的过程，即菌种是基础，发酵是关键，分离纯化是保障。,4,4.1 微生物发酵的类型,按照微生物对氧气的要求、发酵采用的方式、发酵产物的特性，将发酵分为不同的类型：4.1.1 按照微生物对氧气的要求分类1、好氧发酵：指发酵产物形成时需要充足的氧气。如柠檬酸发酵、草酸发酵、谷氨酸发酵以及各种抗生素发酵等。2、厌氧发酵：指发酵时不需要提供氧气，如丙酮-丁醇发酵、乳酸发酵、丙酸发酵、丁酸发酵等。3、兼性厌氧发酵：产生酒精的酵母菌是一种兼性厌氧微生物，在缺氧条件下进行酒精发酵，积累酒精，在大量通气条件下则进行好氧发酵，产生大量酵母细胞。,5,4.1.2 按微生物发酵采用的培养基状态分类,1、固体发酵 固态发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度下的固态基质中，用一种或多种微生物的一个生物反应过程。,6,固体发酵的优点：操作简便、发酵过程容易控制、对无菌要求相对较低、不易发生大面积的污染；基质含水量低，生物反应器的体积小；发酵的副产物可以综合利用，不需废水处理；供氧由气体扩散或间接通风完成，能耗低；能在一定程度上解除产物抑制，可获得较高的次级代谢产物。,7,缺点：厂房面积大；生物反应器设计不够完善；难以准确测定含水量、菌体量和二氧化碳生成量等发酵参数；微生物生长速度缓慢，容易污染；只适合用于耐低活性水的菌等的发酵。,8,2.液体发酵,液体发酵的方式：1、将培养基放在瓷盘内，进行静止培养，称浅盘发酵（表面发酵）。该法存在不少的缺点，如劳动强度大，占地面积大，产量小，易染杂菌等，因此迅速被液体深层发酵所取代。2、将培养液放入不锈钢制成的发酵罐，在罐内进行深层发酵。,9,液体深层发酵的优点：1、液体为悬浮状态为许多微生物提供最适合生长环境，菌体生长快，发酵产率高，发酵周期短；2、在液体中，菌体、底物、产物以及发酵产生的热量易于扩散，使发酵可在均质条件下进行，易于控制，便于扩大生产规模；3、厂房面积小，生产效率高，易进行自动控制，产品质量稳定；4、产品易于提取和精制。但液体深层发酵消耗能源多，设备复杂，需要较大的投资，有废物排除等缺点。,10,4.1.3 发酵的一般工艺过程,微生物发酵产物虽然多种多样，发酵类型不一，但总体上的工艺流程是相似的，包括以下过程：1、原料的处理和灭菌；2、空气的净化除菌；3、菌种的扩大培养；4、发酵的条件控制；5、产品的提取精制等阶段。,11,4.2 原料的选择及处理,培养基是微生物生长繁殖需要的营养环境。培养基成分包括碳源、氮源、无机盐、微量元素和水等。4.2.1 选择合适的原料标准：1、原料中碳的可利用率高；2、发酵率高，而且尽可能使发酵残余物少；3、原料质量好，成分稳定，污染变质少，易灭菌；4、廉价，来源方便，易于保藏。,12,4.2.2 淀粉水解糖的制备,淀粉是由葡萄糖组成的生物大分子，除少数霉菌可以直接利用淀粉外，目前大多数微生物都不能直接利用淀粉，如氨基酸产生菌、酒精酵母、抗生素产生菌等。因此在氨基酸、抗生素有机酸等的生产中，都要求先对淀粉或淀粉原料进行糖化，制成淀粉水解糖后使用。将淀粉水解为葡萄糖的过程称为糖化，制得的糖溶液叫淀粉水解糖。,13,一、淀粉水解糖的制备方法,葡萄糖值-DE值,工业上用DE值（也称G值）表示淀粉糖的糖组成。糖化液中的还原糖含量（以G计算）占干物质的百分率称为。,还原糖含量DE值=100%干物质含量,用于制备淀粉的原料主要有薯类、玉米、小麦、大米等富含淀粉的农产品。根据原料淀粉的性质及采用的催化剂不同，淀粉水解为葡萄糖的方法有酸解法、酶解法以及酸酶结合法等三种。,14,又称酸糖化法，它是以酸为催化剂在高温下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。优点：生产方便，设备简单，水解时间短，设备生产能力大；缺点：a反应在高温高压及酸条件下进行，对设备有耐腐蚀、耐高温和耐高压的要求；b发生副反应，葡萄糖损失，淀粉的转化率低；c对原料要求严格。,1、酸解法,15,酶解法是利用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的方法。酶解法可分为两步：第一步，利用-淀粉酶将淀粉液化；第二步，利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解转化为葡萄糖。生产上这两步分别称为液化和糖化。由于在该过程中淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的。因此酶解法又称为双酶法或多酶法。,2、酶解法,16,1.酶解法是在酶的作用下进行的，反应条件较温和，不需要耐高温高压或耐酸腐蚀的设备；2.酶作为催化剂的特点是专一性强，副反应少，故水解糖液纯度高，淀粉转化率高；3.可在较高的淀粉乳浓度下水解。如酸解法一般使用含18%-20%淀粉的淀粉乳，而酶解法可用含34%-40%淀粉的淀粉乳，并且可以采用粗原料。4.用酶解法制得的糖液较纯净、颜色浅、无苦味、质量高，有利于糖液的充分利用。,优点,17,缺点,酶解法反应时间较长，设备要求较多，且酶是蛋白质，易引起糖液过滤困难。当然，随着酶制剂生产及应用技术的提高，酶解法制糖将逐渐取代酸解法制糖。,18,3酸酶结合法,酸酶结合法是集中了酸解法和酶解法制糖的优点而采用的生产方法，它又可分为：A、酸酶法：是先将淀粉用酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解成葡萄糖的工艺。一般采用将淀粉先用酸水解到DE值达10-15，在降温中和后，用糖化酶进行糖化。优点：酸液化速度快，糖化时可以采用较高的淀粉乳浓度，提高生产效率；酸用量少，产品的色泽浅，糖液质量高。,19,B、酶酸法：是先将淀粉乳用-淀粉酶液化到一定程度，再用酸水解成葡萄糖的工艺。有些淀粉原料颗粒大小不一，如用酸法水解，则常使水解不均匀，出糖率低。生产中应用酶酸法，可采用粗淀粉为原料，粉料浓度较酸解法高，生产易控制，耗时短，且酸解时PH值稍高，以减轻淀粉水解的副反应。从水解糖的质量和降低糖耗，提高原料的出糖率来看，酶解法最好，酸解法最差。从制糖过程所需的时间看，酸解法最短，酶解法最长。,20,4.2.2.2 淀粉酸水解原理及技术,1、淀粉酸水解原理,水解过程：,水解过程中存在三大化学反应：,复合二糖 复合低聚糖 水解淀粉 葡萄糖 5-羟甲基糖醛 有机酸、有色物质,1,3,2,21,（1）水解反应速度,（C6H10O5)n+nH2O n C6H12O6,酸,影响水解反应速度常数k的几个因素,k=N,1）为催化剂活性系数,各种酸的值,2）N为酸的摩尔浓度,3）为多糖的水解性常数,22,4）为水解温度,不同温度下淀粉水解反应速度常数,结论：淀粉水解所用的催化剂种类、浓度、反应温度均对水解反应速度有很大的影响，是我们在水解过程中必须注意的主要因素。,（2）葡萄糖的复合反应,2C6H12O6 C12H22O11+H2O,酸和热,复合反应中两个葡萄糖分子通过复合反应聚合成二糖时，并不是经过1，4-糖苷键聚合成为麦芽糖，而主要是经由1，6-糖苷键聚合成异麦芽糖或经由1，6-糖苷键聚合成龙胆二糖。当然此复合反应是可逆的，复合糖可以再水解变成葡萄糖。,23,（3）葡萄糖的分解反应,葡萄糖（失水）5-羟甲基糠醛+甲酸 腐植质（色素）,实验结果证明：1）5-羟甲基糠醛是产生色素的根源；2）色素的生成量随葡萄糖浓度的增加而增加；3）PH值等于3时，色素的生成量最小。,酸法水解淀粉过程中，由于反应温度、压力过高，时间过长，葡萄糖受酸和热的影响发生分解反应，生成5-羟甲基糠醛，因5-羟甲基糠醛的性质不稳定，又可进一步分解生成乙酰丙酸、蚁酸等物质，而这些物质又能自身相互聚合，或与淀粉中所含的其他有机物质相结合，产生色素。,24,1）酸法糖化工艺流程,淀粉,盐酸,蒸汽,水,调浆,糖化,冷却,中和脱色,压滤,滤渣,糖液,活性炭,Na2CO3,2、酸水解工艺,淀粉的酸水解工艺是根据淀粉在水解过程中的水解反应和复合反应规律性来决定的。在制定工艺条件时既要保证淀粉的彻底水解，达到较高葡萄糖量，又要尽可能减少葡萄糖复合、分解反应的发生程度，此外，还要符合目的产物的发酵条件，符合发酵工艺的实际情况。,25,2）水解条件选择及其控制,1、淀粉乳浓度的选择,2、HCl用量,浓度控制在18-19BX。,用量为淀粉量的0.6%-0.7%，淀粉乳的PH为1.5左右。,26,3、水解时间,4、水解设备,一般15min，水解终点的检查，用无水酒精检查无白色为止。,不锈钢或搪瓷衬底设备。,5、糖化液,6、脱 色,冷却降温，并加纯碱中和调节PH为，温度控制在60-70。,活性炭脱色，添加量为淀粉量的，在，温度65，搅拌脱色30min，经过滤掉蛋白质等杂质，即获得较纯的水解糖。,27,4.2.2.3 双酶法制糖原理,酶解法也称双酶法，它是由淀粉酶和糖化酶将淀粉糖转化为葡萄糖的方法。酶解法优点：以作用专一性的酶制剂作为催化剂，因此反应条件温和，复合和分解反应较少，因此采用酶法生产不仅可提高淀粉的转化率及糖液的浓度，而且还可大幅度地改善了糖液的质量，是目前最为理想、应用最广的制糖方法。缺点：时间长；过滤难。,28,1、淀粉酶解法的两个步骤,酶 水解位置 水解次序 水解产物液化 淀粉酶 1，4糖苷键 无先后次序 葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖 异麦芽糖、低聚糖糖化 糖化酶 1，4和1，6 从非还原性 葡萄糖 糖苷键 末端开始,一、液化过程，采用高温-淀粉酶，将高温糊化了的淀粉液化，生成糊精及低聚糖，使淀粉和其结合蛋白分离；二、糖化过程，利用糖化酶将液化生成的糊精、低聚糖进一步水解生成葡萄糖。,29,淀粉糊化 是指淀粉受热后，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失，互相接触变成糊状液体，即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀的现象。,由于淀粉颗粒的结晶性结构对酶作用的抵抗力非常强,不能使淀粉酶直接作用于淀粉,而需要先加热淀粉乳,使淀粉颗粒吸水膨胀、糊化，破坏其结晶性的结构。,1、液化原理,1）淀粉的糊化与老化,30,糊化温度：发生糊化现象时的温度称为糊化温度，一般来讲，糊化温度有一个范围。不同的淀粉有不同的糊化温度。淀粉的老化：分子间氢键已断裂的糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程，也就是复结晶过程。老化的弊端：淀粉酶很难进入老化淀粉的结晶区起作用，使淀粉很难液化，更不能糖化。糊化淀粉是在淀粉酶的作用下液化的，-淀粉酶可以水解淀粉分子链的-1，4糖苷键，不能水解-1，6糖苷键，但能越过-1，6糖苷键继续水解-1，4糖苷键，水解没有规律性的先后次序。,31,2、糖化的原理 糖化酶又称糖化型淀粉酶或葡糖淀粉酶，它对底物作用是从非还原性末端开始切割，一个分子切割下葡萄糖单位。它不但可以水解-1，4糖苷键，而且也水解-1，6糖苷键和-1，3糖苷键。它可以直接将淀粉水解成葡萄糖，也能水解糊精、低聚糖，最终产物转化为葡萄糖。,酶的用量,原则：酶活力低，液化液浓度高，用量则多，反之则少。生产用量：30%淀粉，80-100单位/克淀粉。,32,4.2.3 糖蜜预处理,1、糖蜜稀释：糖蜜在处理前要加水稀释，加水量为1：1，否则黏度太高不利于后续操作；2、糖蜜澄清：由于其中含有大量灰分和胶体，不但影响菌体的生长，也影响产品的纯度，胶体使发酵中产生大量泡末，影响发酵；3、脱钙调PH值：对酸性原料，PH应该调得比碱性原料要高些，因为它具有延时缓冲性，用它配制的培养基在灭菌后会酸化；而碱性原料的性质正好相反。调PH一般用硫酸或碳酸钠，调。4、调节金属离子的浓度：最常用的方法是采用添加黄血盐（亚铁氰化钾）或EDTA等络合剂、离子交换树脂和活性碳吸附。,33,4.3 灭菌与空气净化工程,4.3.1 培养基湿热灭菌方法及设备 灭菌原理：当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质和酶的基本成分-蛋白质发生不可逆的变化，使微生物在很短时间内死亡。以能否杀死细菌的芽孢为标准。杀死微生物的极端温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间。,34,4.3.1.1 连续灭菌及设备,连续灭菌也叫连消，将配制好的培养基在高温快速的情况下，向发酵罐输送的同时经过加温，保温，冷却的过程进行灭菌。其灭菌的温度一般以126-132为宜。连续灭菌时培养基可瞬时被加热到144，并保持此温度至灭菌要求，也能很快地被冷却，因此是高温瞬时灭菌法，有利于减少培养基中的营养物质的破坏。,35,36,连续灭菌的基本设备一般包括：1、配料预热罐：将配制好的料液预热到60-70，以免连续灭菌料液与蒸汽温度相差过大而产生水气碰击声。2、连消器：主要作用是使高温蒸汽与料液迅速接触混合，并使料液的温度很快提高到灭菌温度。3、维持罐：连消器加热的时间很短，仅靠这段时间灭菌不够，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下保持5-7min，以达到灭菌的目的。4、冷却器：从维持罐出来的料液要经过冷却器进行冷却（40-50）。,37,38,连续灭菌的优缺点及注意事项优点：1）培养基受热时间短，可缩短发酵周期；同时培养基成分破坏也较少。2）蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高，操作方便。3）适于自动控制，降低劳动强度。缺点：设备复杂，投资大。注意事项：1）连消前，应先进行空罐、维持罐、冷却系统的灭菌。2）确保管路无渗漏。,39,4.3.1.2 间歇灭菌及设备,间歇灭菌法：将配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所有设备仪器一起加热，达到预定灭菌温度后维持一段时间，再冷却到发酵温度的湿热灭菌的过程，也称实罐灭菌。间歇灭菌的过程一般包括升温、保温和冷却三个阶段。间歇灭菌时，加热和冷却所需的时间长，且发酵罐容积越大，时间越长，就增加了发酵前的准备时间，也相应地延长了发酵周期，使发酵罐的利用率下降。,40,1、在进行培养基灭菌之前，通常应先把发酵罐的分空气过滤器灭菌并用无菌空气吹干。2、预热：向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基加热至70左右。作用：减少冷凝水的生成；减轻噪音。3、开启蒸汽管，向培养基中通入蒸汽，升温。4、罐压达0.1 MPa时，按装在发酵罐封头的接种管、补料管、消泡剂管等应排汽。,41,5、保温：调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度保持在一稳定水平，维持一定时间。在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道都应通入蒸汽；在液面上的其余管道则应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底，不留死角。6、保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀；待罐内压力降至0.5kg/cm2左右时，向罐内通入无菌空气，向夹套或蛇管中通入冷水，使培养基降至所需温度。通入无菌空气的作用：加速降温；保持罐内正压。,42,间歇灭菌的优缺点优点：1）不需专门的灭菌设备，投资少、设备简单、灭菌效果可靠。2）对蒸汽的要求较低，一般3-4kg/cm2即可满足。缺点：在灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，中小型罐经常采用。,43,4.3.2 空气净化及设备,4.3.2.1 空气净化的要求 发酵用的无菌空气,就是将自然界的空气经过压缩,冷却,减湿,过滤等过程达到:,44,空气净化的方法：（1）热灭菌法：加热后微生物体内的蛋白质热变性而死亡。空气在进入培养系统之前，一般需要经过压缩机压缩，提高压力，所以，空气热灭菌时所需要的温度，就不必用蒸汽或其它载热体加热，而可直接利用空气压缩时的温度提高来实现的，空气经过压缩后温度能够升到200以上，保持一定时间后，便可以实现干热灭菌。,45,（2）静电除菌法：使用静电除尘器除去空气中的水雾尘埃等，同时也除去空气的微生物。静电除菌是采用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的。悬浮于空气中的微生物及孢子大多带有不同的电荷，不带电荷的微粒进入高压静电场时也会被电离成带电微粒，但对于一些直径较小的微粒，所带电荷少，微粒就不容易被吸附沉降。,46,过滤介质,绝对过滤,深度过滤,介质的空隙小于被拦截的微生物大小，如用聚四氟乙烯或纤维素酯材料做成的微孔滤膜。,介质孔隙大于被拦截的微生物大小，但介质有一定厚度，机理是静电，扩散，惯性及拦截作用。如棉花过滤器，超细玻璃纤维纸，金属烧结管等。,（3）介质过滤除菌,47,48,介质过滤除菌法是采用定期灭菌干燥介质来阻截流过的空气所含的微生物，从而获得无菌的空气。棉花：未脱脂棉花，纤维直径为16-20m，其实密度为1520Kg/m3。填充率为8.5-10%。玻璃纤维：用无碱的玻璃纤维介质作为过滤介质。纤维直径为3-20m，其实密度为2600Kg/m3。填充率为5-11%。活性炭：常与纤维状介质分层堆放成过滤床。通过过滤器的气流速度一般为。,3,49,4.3.2.2 空气净化流程及提高过滤除菌的效率措施,空气净化过程中，要保持深层介质过滤器在较高的效率下对空气进行过滤除菌，必须有：供气设备（空气压缩机），对空气提供足够的能量；高效的过滤除菌设备（空气过滤器），以除去空气中的微生物颗粒；一系列加热、冷却及分离和除杂的附属设备来保证。,50,1）.两级冷却，加热除菌流程,特点：两次冷却，两次分离，适当加热。适应性广，充分分离油水，节约冷却水。,51,2）.冷热空气直接混合式空气除菌流程 特点：省去第二冷却后的分离设备和空气再加热设备，流程比较简单，冷却水用量少。适用于中等湿度的地区。,52,3）.高效前置过滤空气除菌流程,53,2、提高过滤介质除菌效率的措施,如何提高过滤除菌效率,设计合理预处理设备 选择合适净化流程,保证进口空气的洁净度。,降低空气相对湿度保证过滤介质干燥,合理空气过滤器，除菌效率高的过滤介质,54,4.5 菌种的培养,4.5.1 菌种的扩大培养 菌种的扩大培养就是为每次发酵罐投料，提供相当数量的种子。4.5.2 发酵阶段的条件控制 反映发酵过程变化的参数分为两类：一、是可以直接采用特定的传感器检测的参数，如温度、罐压、搅拌功率、转速、泡沫、发酵液的黏度等称为直接参数；二、难以用传感器检测到的数据，如细胞的生长速率、产物生成情况等，称为间接参数。上述参数中，对发酵过程影响较大的有营养浓度、温度、溶氧、PH、泡沫等。,55,4.5.2.1 营养条件的控制,（1）碳源和氮源之比 在发酵培养基的配制过程中，要严格控制好碳氮比、无机盐、维生素和金属离子的浓度的比例，其中碳氮比的影响最为明显。如谷氨酸发酵碳氮比为4：1时，菌体大量繁殖，积累少量的谷氨酸；而碳氮比为3：1时，则产生大量的谷氨酸，菌体增殖受到抑制。生产上用控制碳氮比以满足菌体大量繁殖，同时又能促进谷氨酸的产量。,56,（2）补料 在分批发酵中糖过多，会造成细胞生长过旺，供氧不足，产量低。解决这一问题的方法是间歇或连续进行补糖和补料。如在发酵进入产物合成期时及时补料，可以延长产物合成的旺盛阶段，避免菌体过早衰老，也可控制PH和代谢方向。如生产利福霉素的过程中，根据还原糖的变化，中途加葡萄糖延长利福霉素的合成期。补料方法可采用一次大量补料或连续流加的方法。,57,1、温度的影响 温度对发酵的影响表现在影响酶的反应速率，改变菌体代谢产物的合成方向，影响微生物的代谢调控机制；还影响到发酵液的黏度、氧在发酵过程中的溶解度，某些基质的分解和吸收速率等，进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。,4.5.2.2 温度的影响及控制,58,2、影响发酵温度的因素 在发酵过程中温度是不断变化的。发酵开始微生物处于延迟期，释放热量少，应提高温度，满足菌体生长的需要；当微生物进入对数期，菌体进行呼吸作用和发酵作用，放出大量的热，温度剧烈上升；发酵后期，呼吸和发酵作用逐渐缓慢，释放热量少，温度下降。在发酵过程中，引起温度变化的因素有生物热、搅拌热、通气热、蒸发热、辐射热和显热。发酵热是发酵过程中释放出的净热量。,Q发酵=Q生物+Q搅拌+Q通气-Q蒸发-Q显 Q辐射,59,A、生物热（Q生物）,在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。,这种热的主要来源是培养基中的碳水化合物、脂肪和蛋白质等分解为二氧化碳、氨气、水和其他物质时释放出来的。,60,B、搅拌热：在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生的热量。搅拌热受搅拌设备、搅拌方式和发酵液的粘度等影响。C、通气热：是指通入空气温度高于发酵液温度时所产生的热量。通气热的大小，取决于通入的空气和发酵液的温度差和通气量。,61,D、蒸发热：发酵液蒸发水分带走的热量。空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进行热交换，同时必然会引起水分的蒸发，蒸发所需的热量即为蒸发热。E、显热：发酵排气散发带走的热量。F、辐射热：由于罐内外的温差，辐射带走的热量。因罐内外的温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。辐射热的大小决定于罐内外的温差、罐的表面积等。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的5,62,3、温度控制,温度过高、过低均对微生物发酵不利。过高微生物很少繁殖并很快衰老死亡；过低微生物生长缓慢，发酵时间很长，所以发酵要在最适的温度下进行，但生长最适温度不一定是积累产物的最适温度。因此要控制好发酵各阶段的不同温度，使微生物大量生长繁殖，又可得到大量产物。温度影响微生物生长的机理：(1)影响酶活性。(2)影响细胞膜的流动性。(3)影响物质的溶解度。,63,温度对微生物发酵的影响,1）温度影响产物合成的速率及产量 从酶动力学来看，温度升高，反应速率加大，代谢加快，生产期提前；但因酶本身很易因热而失去活性，温度越高，酶的失活也越快，表现在菌体易于衰老，发酵周期缩短，影响产物的最终产量。温度除了直接影响发酵过程中各种反应速率外，还通过改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物合成。黑曲霉生长最适温度33-37，积累柠檬酸的最适温度在32。,64,2）温度可能会影响终产物的质量 例如凝结芽孢杆菌合成-淀粉酶时，发酵温度控制在55时，合成的-淀粉酶耐高温，在90、60min条件下，其活性丧失仅10左右，而发酵温度控制在35时，合成的-淀粉酶在相同条件下丧失90。3）温度还可能影响生物合成的方向 例如：四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。在低于30下，该菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例提高；在温度达到35时，则只产生四环素，金霉素的合成停止。,65,4.5.2.3 溶氧的影响及控制,1、溶解氧影响 由于氧在水中的溶解度很小，在培养基中的溶解度更小，而微生物细胞只能利用溶解氧，很少能直接从空气泡中获得氧，所以需要不断通风和搅拌，才能满足发酵需氧的要求。引起溶解氧异常升高的原因：a、菌体代谢出现异常，耗氧能力下降，使溶解氧上升；b、污染烈性噬菌体，产生菌未裂解前，呼吸受到抑制，溶解氧可能迅速上升，到菌体破裂后，完全失去呼吸能力，溶解氧直线上升。,66,发酵工艺中引起溶解氧异常下降的原因有：1、污染好气性杂菌，大量的溶解氧被消耗掉，可能使溶解氧短时间内降到零附近，如果杂菌本身好养量不强，溶解氧变化可能也不明显；2、菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加，使溶解氧下降；3、某些设备或工艺控制发生故障或变化，也可能引起溶解氧下降。如搅拌速度变慢，影响供氧能力，也会使溶解氧迅速下降。,67,2、溶解氧浓度的控制,发酵液的溶解氧浓度是由供氧和需氧两方面决定的。当供氧量大于需氧量时，溶解氧浓度上升，直至饱和；如需氧量大于供氧量，溶解氧浓度则下降。因此控制溶解氧浓度应从供氧和需氧两个方面考虑。（1）影响供氧的因素a、增加空气中氧的含量，使氧分压增高；b、提高罐压力；但同时会增加CO2的溶解度影响pH，可能会影响菌的代谢。c、调节通风速率；d、调节搅拌转速。,68,（2）影响耗氧的因素a、菌龄影响耗氧：呼吸旺盛，耗氧力强，发酵后期菌体处于衰老状态，耗氧能力自然减弱。b、培养基的成分和浓度显著影响耗氧：培养液营养丰富，菌体生长快，耗氧量大；发酵液浓度高，耗氧量大；发酵过程补料或补糖，微生物对氧的摄取量随着增大。C、发酵条件影响耗氧：在最适条件下发酵，耗氧量大。,69,不同种类微生物，对pH要求不同；,酵 母：pH 3.86.0,细 菌：pH 6.57.5,霉 菌：pH 4.06.0,放线菌：pH 7.08.0,4.5.2.4 PH的影响及控制,1、PH的影响,70,pH不同，微生物代谢产物不同,黑曲霉,pH：23，柠檬酸发酵,pH：7.0，草酸发酵,谷氨酸菌,pH：78，谷氨酸发酵,pH：5.05.8，谷氨酰胺发酵,酿酒酵母,pH：，乙醇发酵,pH：8.0，甘油发酵,71,微生物生长和发酵的最适宜pH可能不同。,丙酮丁醇菌,生长：pH 5.57.0;,发酵：pH 4.3-5.3;,链霉素菌,生长：,发酵：,青霉素菌,生长：,发酵：,72,a、影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；b、影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的排泄；c、影响培养基中某些组分的解离；d、pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。,pH值对发酵的影响,73,2、发酵过程中pH值的调节及控制,最适pH值的确定：根据实验结果 不同的pH值出发进行发酵，发酵过程中定时测定和调节pH值以维持出发pH值，或者利用缓冲液配制培养基来维持。定时观察菌体的生长情况，以菌体生长达到最高值的pH值为生长最适pH。同样的方法可测得产物合成的最适pH值。但同一产物的最适pH值，还与所用的菌种、培养基组成和培养条件有关。,74,在发酵过程中使pH稳定在最适合的范围的方法1、在设计培养基时考虑到维持pH的需要。选择合适的营养物和适当的配比，使发酵过程中的pH维持在合适的范围。2、生理酸性和生理碱性物质的利用。中和代谢过程中产生的碱或酸，以维持一定的pH。3、缓冲液的利用。在培养基中加入碳酸钙或磷酸盐，可以减缓发酵液中pH的变化。4、通过中间补料控制pH。通过补加糖、玉米浆、氨水以及通氨等来调节发酵过程的pH变化。,75,4.5.2.5 发酵过程中泡沫的影响和控制,微生物在深层培养过程中由于通风和搅拌、代谢气体的逸出以及培养基中糖、蛋白质、代谢物等稳定泡沫的活性物质存在，使发酵液中产生大量的泡沫。泡沫产生的原因：1、强通风搅拌而造成的泡沫；2、培养基某些成分如蛋白胨、玉米浆等主要的发泡物质所产生。3、代谢产生的气体也能产生泡沫。,76,1、泡沫的影响 这些泡沫的存在可以增加气液接触面积，增加氧传递的速率。但也给发酵带来不利的影响。1）干扰通气；2）妨碍菌体的生长和代谢；3）菌体得不到必要的溶解氧，也影响二氧化碳的排除；4）引起染菌：由于泡沫增多而引起逃液，增加了染菌的机会；5）泡沫传热差，造成灭菌不彻底；6）泡沫的表面张力会引起产生的酶失活。,77,2、泡沫的控制泡沫的控制，可以采用三种途径：调整培养基中的成分(如少加或缓加易起泡的原材料)或改变某些物理化学参数(如pH值、温度、通气和搅拌)或者改变发酵工艺(如采用分次投料)来控制，以减少泡沫形成的机会。但这些方法的效果有一定的限度。,78,采用机械消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已形成的泡沫：通过化学方法，降低泡沫液膜的表面张力，使泡沫破灭；利用物理方法，使泡沫液膜的局部受力，打破液膜原来受力平衡而破裂。采用菌种选育的方法，筛选不产生泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素，如：杂交选育不产泡沫的土霉素生产菌株。对于已形成的泡沫，工业上可以采用机械消泡和化学消泡剂消泡或两者同时使用消泡。,79,化学消泡法,1、消泡机理,1）降低泡沫的机械强度，使泡沫破裂。,2）降低液膜的表面黏度，使液膜的液体流失，导致泡沫破裂。,当泡沫表层存在着由极性的表面活性物质形成的双电层时，可以加入另一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低泡沫的机械强度；或加入某些具有强极性的物质与发泡剂争夺膜上的空间，降低液膜强度，使泡沫破裂。,当泡沫的液膜具有较大的表面黏度时，可以加入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜黏度。,80,常用的一些消泡剂：天然油脂：常用豆油、玉米油、米糠油。高碳醇、脂肪酸和酯类：十八醇是常用的一种，它可以单独或与载体一起使用。聚醚类；硅酮类；主要是聚二甲基硅氧烷及衍生物，无色液体，不溶于水。纯聚二甲基硅氧烷的消泡能力低，常加分散剂来提高消泡活性。,81,化学消泡最显著的缺点是影响氧气的溶解，使其减少1/31/5，这对微生物供氧极为不利；机械消泡能克服这一缺点，但其应用效果不如化学消泡迅速可靠，不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素。机械消泡是依靠物理学原理，即通过机械力引起强烈振动或压力变化，使泡沫破裂。优点：不需外加物质；节省原材料；减少污染机会。缺点：不能从根本上消除引起泡沫稳定的原因。,物理消泡法,82,4.6 发酵过程中的检验,发酵生产中必须建立一套检验常规，检验的具体项目随不同发酵产品而有所不同，经常检验的项目有：4.6.1 生物学检验 一般是用显微镜观察菌体形态的变化以及无菌检查。1.菌体的观察和吸光度测定 用显微镜检查各个发酵阶段的菌体形态，同时对菌体的生长情况进行吸光度测定。例如，枯草芽孢杆产生蛋白酶发酵过程中的发酵初期，只有营养体，随后芽孢逐渐增多，到发酵后期芽孢达细胞总,83,数的95以上，吸光度不再升高，糖也消耗完，应停止发酵。2、无菌检查 为及时发现杂菌，以便采取有效的措施，对每次无菌取样的发酵液必须进行无菌检查。4.6.2 生化检验1、残糖的测定 发酵过程中糖量变化，可以衡量发酵是否正常。糖消耗越快，说明生长越旺盛，但只有糖份下降，而无发酵产物的增加，应该考虑是否有杂菌污染。残糖测定可作为分批发酵的终点的指标之一，一般认为残糖下降到0.5以下则发酵是彻底的。,84,糖测定方法有物理法和化学法。2、含氮量测定 发酵过程中一般变化不大，一般不测，但某些产品如石油脱蜡等发酵中氮源消耗是判断发酵旺盛或衰败的一个主要标志之一，必须要测定。3、发酵目的产物的测定 如发酵目的物已不再上升，结合碳源已接近耗尽，菌体衰老自溶，温度不在上升，就可以停止发酵。,85,4.6.3 杂菌和噬菌体的污染、防治和挽救4.6.3.1 杂菌污染的检查1、平板划线法2、液体培养基检查法3、显微镜检查法4.6.3.2 噬菌体污染的检查 发酵过程中除容易遭杂菌污染外，还常被噬菌体污染。如谷氨酸发酵过程中的种子或发酵罐污染噬菌体一般都在对数期。此时，发酵液泡沫增多，pH升高，吸光度不增加，二氧化碳下降，耗糖慢或停止。显微镜下发现菌体数量显著减少，形态变粗,86,染色不均匀，细胞壁不整齐，菌体逐渐裂解后出现碎片，发酵液发黏，完整菌体很少，这时怀疑有噬菌体污染。检测方法：a、培养法：发酵液样品离心后，取上清液，取0.1ml置于无菌培养皿内，另取新鲜对数期内的生产菌液0.2ml于之接触，然后倒入固体培养基中培养后观察是否有噬菌体。b、载玻片法：将被检查样品和菌液与含有0.8琼脂的培养基混合，涂于无菌载玻片上，凝固后，经数小时培养，在显微镜下放大观察噬菌体是否存在。,87,4.6.3.3 杂菌污染和防治1、造成杂菌污染的原因a、设备结构不严密；b、空气过滤不彻底，带有杂菌；c、种子不纯，带有杂菌；d、原料灭菌不彻底；e、环境不卫生等。2、污染的防治a、防止种子带入杂菌；,88,b、培养基的彻底灭菌；c、防止空气系统染菌；d、注意环境卫生，建立卫生制度。4.6.3.4 噬菌体污染的防治 噬菌体污染的防治的主要是选育抗噬菌体的菌株。发酵过程中要注意以下事项：A、严禁活菌体排放；B、建立经常性的环境卫生制度；C、把握种子关，严防噬菌体进入种子罐和发酵罐；,89,D、合理布置车间；E、利用药物防治。4.6.3.5 杂菌和噬菌体污染后的挽救 污染后的挽救措施主要根据污染的原因分析，尽可能避免污染扩大，节约原材料，争取得到产品。种子扩大培养过程中发现污染就应放弃种子；,90,发酵早期发现染菌时，可采用接入大量种子，使生产菌占绝对优势，抵制杂菌的繁殖；或立即将发酵液灭菌重新接种；发酵后期染菌，而杂菌又不影响生产菌的正常发酵，也不妨碍产品后处理，则让其共生长；如果杂菌影响发酵的正常进行或产品的后处理，应提前放罐；还可以在发酵液中加入抑制杂菌的物质。,91,发酵前期污染噬菌体应停止搅拌、小通风，立即培养抗性菌株，接入发酵罐，或更换生产菌种；在罐内用夹层加热至70-80，因噬菌体不耐热，加热可杀死发酵液内的噬菌体，冷却后，接入2倍的原菌种，PH正常后再搅拌。发酵初期发现感染噬菌体，可以利用噬菌体只能在生长阶段的细胞中繁殖的特点，将发酵正常并已培养到对数期的发酵液加入感染噬菌体的发酵液中，以等体积混合后再发酵。,92,4.7 发酵培养方法,微生物发酵过程可分为分批发酵、连续发酵、补料分批发酵、混菌发酵、高密度发酵及与产物回收结合的透析发酵、滤膜发酵等方法。不同的发酵技术各有其优缺点，了解生产菌在不同的发酵培养方法下细胞的生长、代谢和产物的变化规律，有助于发酵生产的有效控制。,93,4.7.1 分批发酵,1.概念：在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，然后接入少量的微生物菌种进行培养，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。2.特点：（1）整个培养系统与外界没有其它物质交换；（2）整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度不断变化，是一种非稳态的培养方法。,94,特点,分批发酵过程一般可分为四个时期，即延迟期、对数期、稳定期和衰亡期；也可以分为六期：延迟期、加速期、对数期、减速期、静止期和衰亡期。,95,停滞期,A 现象：刚接种后一段时间，细胞数目和菌量不变，曲线平行于横轴。B.原因：由于细胞进入新环境,细胞数目无增长，甚至有所下降有一个适应过程，进行大量的酶的生成。C.细胞特点:细胞的新陈代谢非常旺盛，个体体积显著增大，但不分裂繁殖，为细胞分裂作准备。,96,D.此期长短：与菌种遗传特性、菌龄、接种量、培养条件有关。,E.意义：在发酵工作中，缩短迟缓期的措施：1）加大接种量（群体优势-适应性增强）；2）用对数期的种子（此时细胞分裂旺盛）；3）调整培养基的成分，使种子基含有发酵培养基的成分；4）选用繁殖快的菌种。,97,加速期,在延滞期后对数期前，细胞生长速率逐渐加快，进入短的加速期。此菌已完全适应周围的环境，由于有充足的营养，而且没有抑制生长的有害物质，菌体开始大量繁殖，很快进入对数期。,98,对数期,1.现象：又称指数期，生长迅速，细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。2.细胞特点：此时细胞的大小、形态、染色性、生理特征等均趋于一致，代谢活跃，对外界环境因素的作用敏感。生长速率高，代时稳定。研究细菌的性状时应选用该期的细菌。,99,减速期,随着营养成分的减少、有害代谢产物的积累，生长速度明显放慢。虽然细胞总数仍在增加，但是细胞的比生长速率开始下降，细胞在代谢与形态方面逐渐衰退，经短时间的减速后进入静止期。,100,静止期,A.现象：活菌数目不增不减，生长速率趋于0,曲线有一下降的趋势。B.细胞特点:有害物增加，死亡数增加，细菌的芽胞、外毒素和抗生素等代谢产物在此期产生，细胞内开始贮藏物质。稳定期细胞数目及产物积累达到最高。,101,衰退期,A 现象：细胞死亡速率 生长速率。一般总菌数不变,活菌数曲线下降。B 特点：死菌数多于活菌数，菌体变形，大小不一，细胞出现自溶,生理代谢活动停滞。所有的发酵产品必须在进入死亡期以前结束发酵。,102,分批培养的优缺点,优点:操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握。缺点:产率低。劳动强度大，而且每批发酵的结果都不完全一样，对分离提纯造成了困难。但由于操作相对较易，目前仍是发酵工业的主要方式。,103,1.概念：微生物培养到对数生长期时，在发酵罐中不断添加新鲜的培养基，同时不断放出代谢物，使微生物细胞在近似恒定状态下生长的发酵方式。2.特点：连续发酵可使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。稳定状态可以有效的延长分批培养中的对数期。在